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.2016年9月16日7:12880。
doi:10.1038/ncomms12880。

CDK1磷酸化折叠复制分叉处的WRN

瓦伦蒂娜·巴勒莫 1, 萨拉·里纳尔杜奇 2, 马西莫·桑切斯 三, 弗朗西丝卡·格里里尼 1, 约书亚·A·索默斯 4, 小罗伯特·M·布罗什 4, 莱洛·佐拉 2, 安娜帕奥拉·弗兰奇托 5, 皮埃特罗·皮奇埃里 1
附属公司

CDK1磷酸化折叠复制分叉处的WRN

瓦伦蒂娜·巴勒莫等。 国家公社. .

摘要

末端处理的调节对于准确修复以及在同源重组（HR）和非同源末端连接（NHEJ）之间切换至关重要。末端切除是一个两阶段的过程，但对远距离切除的调节知之甚少，尤其是对人类而言。WRN参与由DNA2或EXO1介导的两种备选远程切除途径之一。在这里，我们证明了CDK1对WRN的磷酸化对于在复制相关的DSBs进行DNA2依赖性末端切除至关重要，从而促进HR、复制恢复和染色体稳定性。从机制上讲，WRN的S1133磷酸化对于病灶的重新定位是不必要的，但参与了与MRE11复合物的相互作用。WRN磷酸化缺失对MRE11病灶的形成产生负面影响，并以显性负向方式阻止长距离切除，从而使NHEJ在塌陷的分叉处获得许可。总之，我们揭示了WRN-DNA2介导的切除的CDK1依赖性调控，并确定了WRN作为DSB修复通路开关的未描述功能。

PubMed免责声明

数字

图1
图1。WRN蛋白中CDK磷酸化位点的鉴定。
(一)瞬时转染pCMV-Flag-WT-WRN的HEK293T细胞用500 nM足叶乙甙（Etop）3 h、 2个 8 mM HU h或什么都没有。用抗Flag抗体对Flag-WRN进行免疫沉淀（IP），用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，并切除对应于WRN（蓝盒）的条带，用MS进行消化和分析，如b条MS/MS分析确定WRN S1133从依托泊苷处理的样品中磷酸化。不同WRN同源物的多重比对表明S1133高度保守。(c（c）)WRN被CDK磷酸化体内用空载体或表达Flag-WT-WRN的载体瞬时转染HEK293T细胞后，分别用或不用罗斯科汀治疗4个月 h.WRN为IP，带有抗Flag抗体；如图所示，9/10的IP患者接受SDS-PAGE并用抗pS1133WRN抗体进行WB检测，1/10的患者接受抗WRN检测。如有指示，用λ-磷酸酶处理抗Flag IP作为内部对照。用抗WRN抗体对五分之一的裂解物进行印迹，以验证转染。使用抗微管蛋白抗体作为负荷控制。(d日)CDK1以丝氨酸1133为靶点。如图所示瞬时转染的HEK293T细胞接受或不接受RO-3306（CDKi）治疗4次 h、 用抗Flag抗体进行IP，并进行WB，如c（c）如图所示，9/10的IP用SDS-PAGE进行检测，并用抗pS1133WRN抗体进行WB检测，1/10用抗WRN检测。输入斑点中显示的星号来自c（c）和d日表示样品实际上没有用λ-磷酸酶处理，而是来自相应的λ-磷酸酶处理的IP反应中使用的裂解物。
图2
图2。CDK1对WRN的磷酸化促进复制依赖性DSB的远程切除。
(一)WS衍生的SV40转化成纤维细胞的产生稳定表达野生型WRN、S1133A-或S1133D-WRN突变体。Western blotting显示每个稳定细胞系中WRN的表达水平。(b条)在非变性条件下用抗IdU免疫荧光法评估ssDNA。该方案描述了如何在折叠的复制分叉处可视化ssDNA。CPT处理导致复制分叉处的单端DSB，导致核酸酶（pacman）5′-3′切除模板DNA，从而暴露出新生的ssDNA，我们的IdU/ssDNA分析检测到了这一点。为了清楚起见，只代表了由IdU取代的新生主导股。新生DNA预先标记为15 如图所示，在用CPT治疗期间，用IdU维持min和标记。该图显示了两个独立实验测得的IdU/ssDNA染色的平均强度(n个=100，每个生物复制），数据以平均值±s.e.m.表示。IdU/ssDNA染色细胞经CPT处理90天后的代表性图像 min显示在面板中。(c（c）)如图所示，用CPT处理细胞，并通过IF分析pS4/8-RPA32病灶的形成。该图显示了从三个独立实验中获得的pS4/8/RPA32病灶阳性细胞的百分比(n个=150，每个生物复制），数据表示为平均值±标准偏差。面板显示了未经处理和CPT处理的细胞的代表性图像。通过方差分析进行统计分析(****P（P）<0.001; ***P（P）<0.001; NS，不显著）。
图3
图3。S1133处WRN的CDK1依赖性磷酸化影响末端切除的WRN螺旋酶-DNA2依赖性途径。
(一)稳定表达WRN野生型（WRN）的WS-derived细胞重量)，不含磷（WRNS1133A型)或螺旋封头（WRN5.77亿肯尼亚先令)如图2b所示对突变体进行标记和处理，并通过非变性IdU/ssDNA分析进行末端切除。该图显示了IdU/ssDNA染色的平均强度。抗IdU免疫荧光强度由两个独立的实验测定(n个=100，每个生物复制），数据表示为平均值±s.e.m。面板显示了CPT治疗后IdU/ssDNA检测的代表性图像。(b条)Flag-WRNWT、Flag-RNS1133A和Flag-WRNS1133D在分叉DNA底物上具有类似的解旋酶活性。单位0–1250 pM Flag-WRNWT、Flag-WHN1133A和Flag-RNS1133D与分叉DNA底物一起培养，如方法部分所述。面板的量化。数据表示至少三个独立实验的平均值。(c（c）)Flag-WRNWT、Flag-WHN1133A和Flag-WWN1133D在分叉DNA底物上具有可比的核酸外切酶活性。单位0–10 如方法部分所述，用分叉DNA底物培养nM Flag-WRNWT、Flag-RNS1133A和Flag-WHNS1133D。定量一数据表示至少三个独立实验的平均值。
图4
图4。S1133处WRN的CDK1依赖性磷酸化影响末端切除的WRN螺旋酶-DNA2依赖性途径。
(一)WRN磷酸化缺失影响DNA2依赖性末端切除。Western blotting显示表达WRN野生型或其磷酸化突变体的细胞中DNA2缺失。全细胞提取物在48 用DNA2 siRNA转染后h。显示用CPT处理的对照（Ctrl）缺失或DNA2缺失细胞的代表性图像，并对IdU/ssDNA进行免疫染色。该图显示了经DNA2-siRNA处理或未经DNA2-siRNA处理的细胞中IdU/ssDNA染色的平均强度。在两个独立实验中测量了抗IdU免疫荧光的强度(n个=100，每个生物复制），数据表示为平均值±标准偏差(b条)WRN S1133磷酸化缺失影响EXO1介导的降解。Western blotting显示表达WRN野生型或其磷酸化突变体或无WRN（WS）的细胞中EXO1缺失。全细胞提取物在48 转染EXO1 siRNA并用抗EXO1抗体免疫沉淀后h，然后用相同抗体进行WB。末端切除通过IdU/ssDNA分析进行评估。该图显示了从两个独立的实验中量化的单核ssDNA染色的平均强度(n个=100，每个生物复制），数据表示为平均值±标准偏差。通过方差分析进行统计分析(****P（P）<0.0001; **P（P）<0.01; *P（P）<0.05; NS，不显著）。
图5
图5。CPT介导的分叉崩溃后的复制重启受S1133处WRN磷酸化丢失的影响。
(一)标记方案用于通过DNA纤维分析分析未受干扰条件下的复制叉进展。(b条)方框图和胡须图显示了正在进行的分叉的IdU道长度（μm）的10-90%。在两个独立的实验中，在至少100个分离良好的DNA纤维中测量了IdU标记的绿色束的长度(n个=100). 数据表示为平均值±标准偏差（NS，不显著*P（P）<0.1; ***P（P）<0.001; ****P（P）<0.0001; Mann-Whitney检验）。(c（c）)CPT处理细胞中复制分叉重启的分析。按照实验方案中的指示对细胞进行标记和处理，以估计DNA损伤后重新启动的分叉数量。该图显示了重新启动分叉在总分叉数上计算的百分比，不包括恢复期间激发的分叉数（仅IdU标记）。对来自两个独立实验的每个点至少150个单复制叉进行了分析，数据以平均值±标准误差表示(**P（P）<0.01; 方差分析；n个=150). 面板上显示了不同细胞系DNA纤维的代表性图像。
图6
图6。S1133处的磷酸化参与调节WRN与MRE11复合物的关联以及复制依赖性DSB后MRE11病灶的形成。
(一)免疫荧光法分析WRN病灶的形成。按照指示用CPT处理细胞，然后用抗WRN抗体的免疫荧光分析WRN病灶的存在。该图显示了在随机场中计数的WRN病灶阳性细胞的百分比。对于每个时间点，至少从三个独立实验中分析200个细胞。数据以平均值±标准误差表示(n个=300). 面板显示了治疗后WRN病灶形成的典型图像。DAPI用于对细胞核进行反染色。比例尺，5 微米。(b条)Western blotting显示MRE11缺失。制备全细胞提取物48 用MRE11或对照（Ctrl）siRNA转染后h(c（c）)如图所示，用Ctrl或MRE11 siRNA转染细胞，然后分析CPT治疗后WRN病灶的形成。该图显示了随机场中WRN焦点阳性细胞的平均荧光强度的量化。对于每个时间点，至少从三个独立实验中分析200个细胞。数据以平均值±标准误差表示(****P（P）<0.0001; NS，不显著，方差分析（ANOVA）检验；n个=200）。(d日)WRN-MRE11相互作用分析就地解放军。用5 2μM CPT h，并使用抗WRN和抗MRE11抗体接受PLA。该面板显示了PLA的代表性图像，显示了WRN与MRE11的关联。阴性对照显示PLA仅含有抗MRE11抗体的结果。(电子)图中显示了每个PLA阳性细胞的PLA阳性细胞核数（右）和PLA斑点数（左）。从两个独立的实验中，每个实验点至少分析了300个原子核。数值表示为平均值±标准偏差(**P（P）<0.01; ***P（P）<0.001; ****P（P）<0.0001; 方差分析；n个=300). 比例尺，10 微米。
图7
图7。S1133处WRN的CDK依赖性磷酸化调节塌陷分叉处DSB修复途径的选择。
(一)方法中描述的与指定的WRN形式、I-SceI表达载体pCBASce和pDRGFP HR报告质粒共同转染的HEK293TshWRN细胞中I-Sce1诱导的DSB的HR介导修复效率。Western blotting显示HEK293TshWRN细胞中所示WRN形式的表达。图表显示了计算出的与野生型WRN蛋白转染细胞相关的HR效率百分比。(b条)I-SceI诱导的DSB在HEK293TshWRN细胞中的末端连接效率，与指定的WRN形式共同转染，pDRGFP NHEJ报告质粒线性化，如方法中所述。Western blotting显示HEK293TshWRN细胞中所示WRN形式的表达。该图显示了相对于用野生型WRN转染的细胞的NHEJ效率的百分比。数据以三个独立实验的平均值±s.e.m表示(**P（P）<0.01; ***P（P）<0.001; ****P（P）<0.0001; 方差分析（ANOVA）检验；n个=3 × 105). (c（c）)姐妹染色单体互换分析。按照指示处理细胞，并在含BrdU的培养基中恢复36 中期铺展和染色前h，如补充方法所述。该图显示了每个中期细胞姐妹染色单体交换（SCE）的平均数量。从三个独立的实验中，每个实验点至少统计了25个中期（NS，不显著**P（P）<0.01，方差分析；n个=75). (d日)DSB修复效率分析。用5 1μM CPT h，并允许在指定的不同时间点恢复。通过中性彗星试验评估DSB修复。在图中，数据表示为来自三个独立实验（NS，不显著****P（P）<0.0001; Mann-Whitney检验；n个=300). 面板中显示了中性彗星分析的代表性图像。(电子)DNA-PKcs抑制对WRN磷酸化突变体中DSB修复的影响。按照指示处理细胞，并允许细胞在存在或不存在DNA-PKcs抑制剂（DNA-PKi）的情况下恢复。DSBs的存在通过中性彗星测定法进行了评估。在图表中，数据表示为来自三个独立实验的平均尾部力矩±s.e.m(****P（P）<0.0001; Mann-Whitney检验；n个=300).
图8
图8。WRN的CDK依赖性磷酸化是基因组完整性和响应复制依赖性DSBs的生存所必需的。
(一,b条)图表显示了WS和不同的WS补体细胞中所示染色体畸变的每个细胞的平均数。用1 微米CPT 4 h后接24 收集前在无药培养基中回收h。数据表示为三个独立实验的平均值±标准误差(*P（P）<0.05; ***P（P）<0.001; ****P（P）<0,0001; NS，不显著，方差分析（ANOVA）检验；n个=150). (c（c）)克隆存活分析。用CPT处理表达野生型或两种磷酸化突变形式WRN的细胞24小时 记录指示剂量下的h和每个实验点的菌落数，并用未处理对照的百分比表示。数据为两个独立实验的平均值±标准偏差。(d日)WRN磷酸化突变体表达细胞中RAD51的抑制调节对CPT的敏感性。用CPT处理细胞1 h、 如图所示。在CPT治疗前加入B01 RAD51抑制剂，然后恢复细胞18 在通过LIVE/DEAD分析评估细胞死亡之前，在持续存在或不存在抑制剂的情况下放置h。数据以细胞死亡百分比表示，是三个独立实验的平均值(****P（P）<0.0001; ***P（P）<0.001，方差分析检验；NS，不显著；n个=3）。(电子)复制分叉处DSB修复中WRN的CDK依赖性调节的建议模型（详见正文）。
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