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.2016年9月13:6:33030。
doi:10.1038/srep33030。

蛋白酶激活受体-1缺陷对链脲佐菌素诱导的小鼠糖尿病肾病的保护作用

附属公司

蛋白酶激活受体-1缺陷对链脲佐菌素诱导的小鼠糖尿病肾病的保护作用

Maaike Waasdorp公司等。 科学代表. .

摘要

内源性给予的活化蛋白C以蛋白酶活化受体-1(PAR-1)依赖的方式改善糖尿病肾病(DN),这表明PAR-1的活化限制了DN的进展。然而,成纤维细胞样细胞中PAR-1的激活可诱导增殖和细胞外基质的产生,从而引发纤维化疾病。考虑到糖尿病肾病期间系膜增殖和细胞外基质生成的关键作用,PAR-1实际上可能会加重糖尿病诱导的肾损伤。为了确定PAR-1在DN中的净作用,在野生型和PAR-1缺陷小鼠中研究了链脲佐菌素诱导的DN。在PAR-1刺激和抑制后,通过评估体外系膜和肾小管上皮细胞的促纤维化反应,获得了后续的机制性见解。尽管有相似的血糖水平,PAR-1缺陷小鼠在糖尿病诱导后肾损伤较少,表现为蛋白尿减少、血浆胱抑素C水平降低、系膜面积扩大和肾小管萎缩。在体外,系膜细胞中的PAR-1信号传导导致基质蛋白纤维连接蛋白和IV型胶原的增殖和表达增加。相反,在糖尿病PAR-1缺陷小鼠中观察到增殖和纤维连接到蛋白沉积减少。总之,我们表明PAR-1在DN的发展中起着重要作用,因此PAR-1可能是DN的一个有吸引力的治疗靶点。

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数字

图1
图1。减少PAR-1缺陷糖尿病小鼠的肾病。
()实验期间野生型和PAR-1缺陷小鼠的血糖水平。(b条)注射链脲佐菌素(stz)或生理盐水(ctrl)三个月后,野生型和PAR-1缺陷小鼠的血糖水平。(c(c))注射链脲佐菌素(stz)或生理盐水(ctrl)三个月后,Wt小鼠肾匀浆中PAR-1 mRNA的表达。TBP表达作为参考基因。()肾体重比(e(电子))尿白蛋白/肌酐比值,以及((f))注射链脲佐菌素(stz)或生理盐水(ctrl)三个月后,野生型和PAR-1缺陷小鼠的血浆胱抑素C水平。所示为平均值±扫描电镜,重量控制,n = 10; 第1部分−/−控制,n = 7; Wt stz,n(重量标准) = 6; 第1部分−/−stz,n个 = 8.使用Kruskal Wallis和Dunns事后分析、单向方差分析和Bonferroni事后分析以及非配对t检验,*p < 0.05; ****第页 < 0.0001.
图2
图2。PAR-1缺陷糖尿病小鼠的系膜扩张。
()注射链脲佐菌素(stz)或生理盐水(ctrl)三个月后,野生型和PAR-1缺陷小鼠肾脏PAS-D染色石蜡切片的代表性图片。箭头指明系膜扩张的区域。比例尺:50微米。(b条)注射链脲佐菌素(stz)或生理盐水(ctrl)三个月后,对野生型和PAR-1缺陷小鼠肾脏进行Masson’s三色染色石蜡切片。比例尺:50μM。(c(c))糖尿病(stz)、非糖尿病(ctrl)野生型和PAR-1缺陷小鼠肾小球系膜扩张的量化。根据材料和方法一节中的描述,对肾小球评分为正常或偏离。重量控制,n = 5; 第1部分−/−控制,n = 7; Wt stz,n(重量标准) = 6; 第1部分−/−stz,n个 = 8. ()肾小球细胞外基质沉积的组织学评价量化。所示为平均值±扫描电镜,重量控制,n = 5; 第1部分−/−控制点,n = 7; Wt stz,n(重量标准) = 5; 第1部分−/−stz,n个 = 8.分析中排除了一个异常值。(e(电子))糖尿病野生型和PAR-1缺陷小鼠肾小管的代表性图片。箭头指向萎缩的小管,近端小管上皮细胞变平,基底膜增厚。比例尺:50微米。使用了Bonferroni事后分析和非配对t检验的单向方差分析,*p < 0.05; **第页 < 0.01; ***第页 < 0.005.
图3
图3。PAR-1缺乏可防止过度增殖和细胞外基质生成体内.
注射链脲佐菌素三个月后,从野生型和PAR-1缺陷小鼠获得石蜡切片,进行免疫组织化学染色(棕色),随后进行分析。()每50个肾小球中增殖(Ki67阳性)细胞的数量。(b条)每50个肾小球中凋亡(裂解caspase 3阳性)细胞的数量。(c–e类)纤维结合蛋白(c(c)),胶原蛋白IV()和α-SMA(e(电子))每个肾小球的阳性面积。幻灯片的量化显示在左侧面板中,代表性示例显示在右侧。比例尺(适用于所有面板):50微米。指示为平均值±SEM.Wt stz,n(扫描电镜) = 5; 第1部分−/−stz,n个 = 8.采用单侧非配对t检验进行分析*第页 < 0.05; **第页 < 0.01.
图4
图4。PAR-1信号传导导致细胞增殖和细胞外基质产生MES13细胞。
()48天后MES13细胞、HK-2细胞和imPTEC中PAR-1 mRNA的表达用5刺激hmM葡萄糖(LG)或25mM葡萄糖(HG)。TBP表达作为参考基因。(b条)24天后MES13细胞增殖25刺激hmM葡萄糖加和不加p1pal12(5uM)。(c(c))24天后MES13细胞增殖凝血酶刺激h(1U/ml)或PAR1-AP(100μM)在p1pal12(5)存在下μM)或二甲基亚砜。(d–f日)24天后MES13全细胞裂解物中纤维连接蛋白水平的Western blot(下表)和定量(上表)用20刺激hmM甘露醇或25mM葡萄糖(),第1pal12页(e(电子))和凝血酶(1U/ml)或PAR1-AP(100μM),有和没有p1pal12预处理((f)). 所示为平均值±扫描电镜,n = 3个单独实验。使用Bonferroni事后分析和非配对t检验的单向方差分析*p < 0.05; **第页 < 0.01; ****第页 < 0.01.
图5
图5。凝血酶以MEK-p38-PKC和MEK-p28-Src依赖的方式诱导增殖和纤维连接蛋白的产生。
()24天后MES13细胞增殖h凝血酶刺激(1U/ml),在mTOR抑制剂(雷帕霉素,20nM),PKC(切利思林,1μM),甲乙酮(U0126,10μM),p38(SB203580,10μM)或Src(PP1200nM)。(b条)24天后MES13全细胞裂解物中纤维连接蛋白水平的Western blotmTOR抑制剂(雷帕霉素,20nM),PKC(切利思林,1μM),甲乙酮(U0126,10μM),p38(SB203580,10μM),Src(PP1200nM),或(c(c))转化生长因子β(10μM LY364947和10μM SB341542)。()凝血酶刺激指定时间点后MES13全细胞裂解物中磷酸化ERK1/2水平的Western blot。所示为平均值±扫描电镜,n = 3个单独实验。使用Bonferroni事后分析和非配对t检验的单向方差分析*p < 0.05; **第页 < 0.01.

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