The Oncogenic Fusion Proteins SET-Nup214 and Sequestosome-1 (SQSTM1)-Nup214 Form Dynamic Nuclear Bodies and Differentially Affect Nuclear Protein and Poly(A)+ RNA Export

doi:10.1074/jbc.M116.735340

.2016年10月28日；291(44):23068-23083.

doi:10.1074/jbc。M116.735340。 Epub 2016年9月9日。

肿瘤融合蛋白SET-Nup214和Sequestosome-1（SQSTM1）-Nup214Nup214形成动态核体并对核蛋白和Poly（A）+RNA的输出产生不同影响

Sarah A港口¹, 阿德利亚·门德斯², 克里斯蒂娜·瓦尔科娃^三, 克里斯蒂安·斯皮尔纳¹, Birthe Fahrenkrog出生², 克里斯托夫·卡伊特^三, 拉尔夫·凯伦巴赫⁴

附属公司

¹来自德国洪堡塔利23号哥廷根乔治奥古斯特大学医学院分子生物学系和哥廷根分子生物科学中心（GZMB）。
²布鲁塞尔自由大学分子生物学与医学研究所，6041 Charleroi，Belgium，and。
^三莱布尼茨老龄化研究所，Fritz Lipmann Institute，Beutenbergstrasse 11，07745 Jena，Germany。
⁴来自德国洪堡塔利23号哥廷根乔治奥古斯特大学医学院分子生物学系和哥廷根分子生物科学中心（GZMB），rkehlen@gwdg.de。

PMID： 27613868
预防性维修识别码：项目编号：5087727
内政部： 10.1074/jbc。M116.735340

肿瘤融合蛋白SET-Nup214和Sequestosome-1（SQSTM1）-Nup214Nup214形成动态核体并对核蛋白和Poly（A）+RNA的输出产生不同影响

Sarah A港口等。生物化学杂志. 2016.

.2016年10月28日；291(44):23068-23083.

doi:10.1074/jbc。M116.735340。 Epub 2016年9月9日。

作者

Sarah A港口¹, 阿德利亚·门德斯², 克里斯蒂娜·瓦尔科娃^三, 克里斯蒂安·斯皮尔纳¹, Birthe Fahrenkrog出生², 克里斯托夫·卡伊特^三, 拉尔夫·凯伦巴赫⁴

附属公司

¹来自德国洪堡塔利23号哥廷根乔治奥古斯特大学医学院分子生物学系和哥廷根分子生物科学中心（GZMB）。
²布鲁塞尔自由大学分子生物学与医学研究所，6041 Charleroi，Belgium，and。
^三莱布尼茨老龄化研究所，Fritz Lipmann Institute，Beutenbergstrasse 11，07745 Jena，Germany。
⁴来自德国洪堡塔利23号哥廷根乔治奥古斯特大学医学院分子生物学系和哥廷根分子生物科学中心（GZMB），rkehlen@gwdg.de。

PMID： 27613868
预防性维修识别码：项目编号：5087727
内政部： 10.1074/jbc。M116.735340

摘要

基因重排是几种白血病的特征，并可能导致致癌融合蛋白。染色体受累区域的一个例子是Nup214的基因编码，Nup214是一种定位于核孔复合体（NPC）细胞质侧的核孔蛋白。我们研究了两种这样的融合蛋白，SET-Nup214和SQSTM1（隔离体）-Nup114，它们都含有Nup214的C末端部分。在白血病细胞系LOUCY和MEGAL中观察到含有核输出受体CRM1的SET-Nup214核小体。SET-Nup214在HeLa细胞中的过度表达导致形成类似的核小体，这些核小体招募CRM1，输出货物蛋白和某些核孔蛋白，并同时影响核蛋白和聚（A）⁺RNA输出。SQSTM1-Nup214虽然主要是细胞质，但也形成核体并抑制核蛋白，但不抑制poly（A）⁺RNA输出。如联合免疫沉淀实验和结合分析所示，融合蛋白与CRM1的相互作用依赖于RanGTP。进一步分析表明，Nup214部分介导核输出抑制，而SET或SQSTM1部分决定融合蛋白的定位，因此影响程度。SET-Nup214核小体是高度可动的结构，在间期与核质平衡，在有丝分裂期间或用CRM1抑制剂钩体B处理细胞后解体。引人注目的是，我们发现核穿孔蛋白可以从核小体中释放出来并重新整合到现有的鼻咽癌中。我们的结果表明，核体是防止形成潜在不溶性和有害蛋白质聚集体的一种手段，而蛋白质聚集体也可能作为核转运因子的储存室。

关键词：CRM1；编号214；SET；白血病；mRNA；核孔；核运输；细胞核；p62（隔离体-1（SQSTM1））。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
**致癌融合蛋白SET-Nup214和SQSTM1-Nup214.的细胞定位。** A类用Nup214抗体对LOUCY、MEGAL和K562细胞进行染色，并用共焦显微镜进行分析。DNA用DAPI染色(蓝色).尺寸栏，5μm。箭头指向核物体。B，本研究中使用的内源性蛋白、融合蛋白和Nup214片段的示意图。SET（设置）(绿色)、SQSTM1(橙色)，编号214(灰色)，并指出了相关氨基酸残基。C类和D类，用编码N-末端mCherry标记的SET、SET-Nup214、SQSTM1和SQSTM1-Nup214的质粒转染HeLa细胞，并使用α-RFP抗体通过免疫印迹分析标记蛋白的亚细胞定位(C类)或共焦显微镜(D类). 低于70kDa的非特定频带用作负载控制。请注意，含FG的蛋白质通常比计算的分子量稍高(C类). 标签的类型和位置都不会影响融合蛋白的定位（数据未显示）。E类和F类，转染Myc-tagged基因的HeLa细胞(红色)集合编号214(E类)或SQSTM1-Nup214(F类)对细胞隔室（内源性coilin、PML、LAMP2、LC3和SQSTM1）的共同标记蛋白进行染色(绿色)). 编码FusionRed-ER标记和SQSTM1-Nup214-myc的质粒被联合转染；内质网(*急诊室*)在中着色绿色以获得更好的可视化效果。*D–F型*DNA用Hoechst染色(蓝色).尺寸栏，20微米。箭头指向核物体。放大的区域(插入)对应于所示区域的7倍放大。

**图2。**
**SET-Nup214和SQSTM1-Nup214-对核输出受体CRM1定位的影响。** A类和B，用编码Myc-tagged的质粒转染HeLa细胞(红色合并图片中）SET-Nup214(A类)或SQSTM1-Nup214(B)并用抗CRM1或Ran的抗体染色(绿色在合并的图片中）。*尺寸栏*，20微米。C类，LOUCY细胞用Nup214抗体染色(红色)和CRM1(绿色).尺寸栏，5微米。*A–C*，细胞与（+）或不与（−）10n一起孵育米（HeLa细胞）或20 n米（LOUCY细胞）LMB 3 h，如图所示，并通过共焦显微镜进行分析。DNA用DAPI或Hoechst染色(蓝色).箭头以Nup214融合蛋白和CRM1共定位的核体为例。

**图3。**
**SET-Nup214和SQSTM1-Nup214.禁止核出口。** A类和B，HeLa细胞与编码Myc-tagged的质粒共转染(红色)集合编号214(A类)或SQSTM1-Nup214(B)和GFP标记的报告蛋白HIV-1 Rev和SPN1(绿色)分别是。用于分析内源性RanBP1(绿色)，细胞进行间接免疫荧光。SET-Nup214和SQRTM1-Nup214的影响(红色)聚（A）⁺RNA定位(绿色)由分析就地杂交。DNA用Hoechst染色(蓝色).尺寸栏，20微米。C类，对31个表达SET-Nup214的细胞与55个未转染细胞中RanBP1的细胞定位进行量化。这个*蓝色圆点*表示各个数据点。*误差线*表示平均值±S.D灰色区域表示主要的细胞质定位（核/细胞质信号<1）。D类，LOUCY细胞用Nup214抗体染色(红色)和RanBP1(绿色). DNA用DAPI染色(蓝色).尺寸栏，5微米。*A–D*共聚焦显微镜分析细胞。在有指示的情况下，用10n米LMB持续1 h（HeLa）或20 n米LMB持续3小时（LOUCY）。箭头指向带有核体和堆积货物的核。

**图4。**
**SET-Nup214和SQSTM1-Nup214-与出口受体CRM1的结合。** A类和B，共免疫沉淀(*IP（IP）*)带有Myc-tagged SET-Nup214的CRM1(A类)或SQSTM1-Nup214(B). 用编码Myc-SET-Nup214或Myc-SQSTM1-Nup214.的质粒转染HeLa细胞。24小时后，在不存在或存在RanQ69L-GTP的情况下，将细胞裂解并与小鼠IgG或抗Myc抗体共同免疫沉淀。通过SDS-PAGE和免疫印迹分析沉淀蛋白。注意，由于低表达水平，未观察到Myc-tagged SET-Nup214或SQSTM1-Nup214.的输入信号。GST-CRM1型(C类)或GST-Ran(D类)装载有GDP或GTP的被固定在珠子上，并用过量的MBP-SQSTM1-Nup214、CRM1、RanQ69L-GTP、MBP-SQRM1、Nup214（1916-2033）或NES肽培养，如图所示。结合蛋白通过SDS-PAGE和考马斯染色进行分析。C类,降低和上部凝胶的强度和背景设置不同，以提高Nup214片段的可视性。

**图5。**
**融合蛋白单个成分对核输出的影响。**HeLa细胞与编码dGFP-HIV-1 Rev的质粒共转染(*A–C*)或GFP-SPN1(*D–F型*)和N端mCherry-tagged SET(A类和D类)或SQSTM1(A类和D类)或Nup214片段与RFP-cNLS融合(B和E类)如图所示。通过共焦显微镜分析细胞。DNA用Hoechst染色(蓝色).尺寸栏，20微米。箭头指向核物体。C类和F类，量化结果B和E类. The酒吧显示两个独立实验中100个细胞/样本的平均分布。*误差线*，标准偏差。N个>C类以核为主；N个=C类在细胞核和细胞质之间均匀分布；N个<C类，主要是细胞质。

**图6。**
**对核输出的影响由Nup214部分介导，并取决于融合蛋白的定位。** A类，带有交换Nup214片段的两个融合构造的示意图，SET-Nup214（1969-2090）和SQSTM1-Nup214813-2090）。*B–F类*用编码Myc-tagged SET-Nup214（1969-2090）或SQSTM1-Nup214[813-2090）的质粒转染HeLa细胞，并用α-Myc抗体进行免疫印迹分析(B)或共焦显微镜(*C–F*).C–F类，使用抗Myc抗体通过间接免疫荧光检测融合蛋白(红色).C类用内源性CRM1抗体对细胞进行染色。D类和E类，细胞与载脂蛋白dGFP-HIV-1-Rev共转染(D类)和GFP-SPN1(E类).F类，poly（A）的局部化⁺RNA通过就地杂交。*C–F类*,*尺寸条*，20微米。*G公司*和*H（H）*，量化结果D类和E类分别是。这个酒吧显示三个独立实验中100个细胞/样本的平均分布。*误差线*，标准偏差。（*），～90%的细胞在核仁中显示dGFP-HIV-1 Rev的积聚；（**），～20%具有主要细胞质信号的细胞也在核仁中显示dGFP-HIV-1 Rev的积聚；（***），～半数具有GFP-SPN1主要细胞质定位的细胞也表现出报告蛋白与SQSTM1-Nup214在核体中的共同定位；（****），GFP-SPN1与细胞质SQSTM1-Nup214（813–2090）小体共定位。N个>C类以核为主；N个=C类在细胞核和细胞质之间均匀分布；N个<C类以细胞质为主。

**图7。**
**SET-Nup214，而不是SQSTM1-Nup214-影响内源性核穿孔蛋白的定位。**Myc标记的SET-Nup214(A类)和SQSTM1-Nup214(B)在HeLa细胞中表达，并通过共焦显微镜分析内源性核孔蛋白的定位。用抗Myc抗体间接免疫荧光检测融合蛋白(红色). 用10n处理细胞米LMB持续3小时，如图所示。放大的区域(插入)对应于所指示区域的7倍放大率。*尺寸栏*，20微米。

**图8。**
**SET-Nup214的核体是移动的和动态的。** A类，用编码Myc-tagged SET-Nup214或SQSTM1-Nup214-的质粒转染HeLa细胞，用10 n米LMB 1小时，如图所示，并进行亚细胞分级。等效颗粒量(*P（P）*)或可溶部分(*S公司*)SDS-PAGE分离，免疫印迹。B用编码mCherry-SET-Nup214和GFP-组蛋白2A（GFP-H2A）的质粒转染细胞，并用胸苷和诺可唑处理。显示了细胞周期不同阶段的典型示例。*尺寸栏*，10微米。C类和D类，用编码mCherry-SET-Nup214的质粒转染HeLa细胞，并进行FRAP分析。C类，用于FRAP分析的细胞代表性图像。时间点如所示括号. The箭头表明漂白的核体(黑色)另一个来自漂白细胞的核体(*深灰色*)和一个非漂白细胞的核体(*浅灰色*).尺寸栏，10微米。D类，FRAP期间核体荧光定量分析。描述了在400秒的时间过程中，24个单个细胞的核体的平均相对荧光。*误差线*表示平均值±S.D灰色区域表示漂白间隔。E类，用mCherry-SET-Nup214编码质粒转染HeLa细胞，并用10 n米LMB和100μg/ml环己酰亚胺(*瑞士法郎*)如图所示，持续0、30或120分钟。固定后，mCherry-SET-Nup214的定位(红色)和内源性Nup88(绿色)共聚焦显微镜分析。箭头在核体溶解后，指向装有重新整合Nup88的核膜。*尺寸栏*，20微米。

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