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.2016年12月6日;7(49):80521-80542.
doi:10.18632/目标11825。

缺氧通过periostin促进神经胶质瘤相关巨噬细胞浸润,并通过上调TGF-β和M-CSFR促进随后的M2极化

附属公司

缺氧通过骨膜炎素促进胶质瘤相关巨噬细胞浸润,随后通过上调TGF-β和M-CSFR促进M2极化

郭晓凡等。 Oncotarget公司. .

摘要

肿瘤相关巨噬细胞(TAM)在胶质瘤中富集,有助于创造肿瘤免疫抑制微环境。胶质瘤TAM的主要成分是一种独特的M2弯曲型巨噬细胞,这些细胞具有促肿瘤功能。胶质瘤包含大量缺氧区域,M2极化TAM密度与缺氧区域之间存在相关性,表明缺氧在TAM募集和诱导过程中起支持作用。在这里,我们研究了缺氧对人类巨噬细胞募集和M2极化的影响。我们还研究了HIF抑制剂吖啶(ACF)对体内M2-TAM浸润和肿瘤进展的影响。我们发现缺氧增加了胶质瘤细胞中骨膜蛋白(POSTN)的表达,并促进了巨噬细胞的募集。TGF-α通过RTK/PI3K途径增加低氧诱导的POSTN表达,ACF处理低氧细胞可阻断这种作用。我们还证明,缺氧环境和缺氧处理的胶质瘤细胞上清液都能够使巨噬细胞极化为M2表型。ACF通过抑制缺氧条件下巨噬细胞M-CSFR和胶质瘤细胞TGF-β的上调,部分逆转了巨噬细胞M2极化。使用ACF还可以在体内消融肿瘤进展。我们的研究结果揭示了低氧诱导TAM富集和M2极化的机制,并表明通过药物抑制HIF可以减少M2极化TAM浸润和胶质瘤进展。

关键词:M2巨噬细胞;吖啶;胶质瘤;缺氧;肿瘤相关巨噬细胞。

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利益冲突声明

利益冲突

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数字

图1
图1。缺氧、POSTN表达、TAM浸润和M2亚型TAM比例随着胶质瘤分级的增加而增加,均与预后较差有关
答:。IHC染色检测不同级别胶质瘤和正常脑组织标本连续四张组织切片中的POSTN、HIF-1α、CD11b和CD206。比例尺,50μm。B。(A)的图形分析。总的来说,47.8%的神经胶质瘤病例显示出POSTN+和HIF-1α+染色,16.9%和15.5%的GBM病例分别显示出POSTN+/HIF-1α-或POSTN-/HIF-1α+的单阳性细胞。只有19.8%的病例显示这两种阴性染色。C、。TAM标记物CD11b(绿色)和M2型TAM标记CD206(红色)的免疫荧光染色。D。图(C)的图形分析显示,随着胶质瘤分级的增加,TAM浸润和M2型细胞比例增加。使用ImageJ.*分析TAM密度,P<0.05;**,P<0.01;***,P<0.001(n=5个肿瘤;平均值±s.e.m;双尾非配对t检验)。E。胶质瘤组织切片中CD11b(绿色)和HIF-1α(红色)表达的免疫荧光分析表明,TAM富集于HIF-1β丰富的区域。方框中所示的区域被放大并显示在每张图片下方。比例尺,200μm。F类G.公司。22例阳性POSTN和20例阴性POSTN胶质瘤患者的Kaplan-Meier曲线分析表明,POSTN+组预后较差(中位生存期分别为398天和311天,Log-Rank检验,p<0.05)。此外,在22名POSTN阳性患者中,HIF-1α阳性患者的预后更差(中位生存期:378天vs 218天,Log-Rank检验,p<0.05)。H。肿瘤中CD11b+TAM浸润高的胶质瘤患者术后生存时间短于CD11b表达低的患者(中位生存期:391天vs 311天,Log-Rank检验,n=42,p<0.05,患者信息见补充表S1)。
图2
图2。胶质瘤细胞低氧诱导的POSTN分泌促进巨噬细胞的募集
答:。POSTN(绿色)和HIF-1α(红色)免疫荧光染色。比例尺,100μm。B。图(A)的图形分析显示,HIF-1α和POSTN的表达均随着胶质瘤分级的增加而增加。用ImageJ.*分析HIF-1α和POSTN的表达,P<0.05;**,P<0.01(n=5个肿瘤;平均值±标准差;双尾非配对t检验)。C、。对暴露于缺氧条件下的U87和U251细胞中的POSTN和HIF-1α水平进行Western blot分析,结果表明它们随着时间的推移而增加。D。跨孔分析中THP-1巨噬细胞样细胞向不同浓度rPOSTN迁移的代表性图像。比例尺,100μm。(D)的图形分析显示THP-1诱导巨噬细胞以剂量依赖的方式向rPOSTN迁移。E类F、。THP-1巨噬细胞样细胞向常氧或缺氧处理的U87或U251细胞培养上清液迁移的典型图像,这些上清液预先培养有或没有抗POSTN抗体。(E)和(F)的图形分析表明,应用抗POSTN抗体可以减弱巨噬细胞向缺氧处理的胶质瘤细胞上清液迁移的增加。比例尺,100μm。G公司H。从U87和U251细胞获得的THP-1巨噬细胞样细胞向不同条件培养上清液迁移的代表性图像。一、。(E)和(F)的图形分析表明,在诱导缺氧之前,用siPOSTN转染细胞,可以逆转THP-1诱导的巨噬细胞向缺氧处理的U87和U251细胞上清液的迁移增加。此外,缺氧期间用ACF预处理U87或U251细胞也消除了这一趋势。J。Western blot分析转染siPOSTN(1205或876)或载体的U87或U251细胞中的POSTN水平。英国。(J)的图形分析显示,在U87和U251细胞中,siPOSTN组的POSTN表达显著降低。使用ImageJ软件测定POSTN的相对表达水平。结果显示为平均值±s.e.m.(n=3;*,P<0.05;双尾非配对t检验)。L。THP-1巨噬细胞在PBS或ACF(3μM)存在下向完整PRIM-1640培养基迁移的典型图像。M。对(L)的图形分析表明,ACF对巨噬细胞迁移没有直接影响。五、。THP-1巨噬细胞在常氧或缺氧环境中向U87/U251细胞条件培养基迁移的典型图像。O。(V)的图解分析显示巨噬细胞的迁移活性因缺氧而受损。所有transwell分析重复三次。*,P<0.05;**,P<0.01;NS,P>0.05(n=5个字段,平均值±标准偏差,双尾非配对t检验)。
图3
图3。缺氧增加了转化生长因子-α的分泌,随后通过RTK/PI3K途径增强了U87和U251细胞中POSTN的表达
A类B。用10 ng/ml TGF-α处理U87和U251细胞12、24和48小时。然后分析POSTN的蛋白表达水平(单向方差分析)。C类D。将U87和U251细胞用载体(DMSO)、PD153035(10μM)或LY294002(10μM)预处理1 h,然后添加TGF-α48 h。然后分析POSTN表达(双尾非配对t检验)。E类F、。低氧刺激使TGF-α和POSTN表达增加,且呈时间依赖性。分析TGF-α和POSTN的表达(单向方差分析)。G公司H。在细胞暴露于常氧或缺氧条件(双尾非配对t检验)之前,用信号通路抑制剂LY294002(10μM)或PD153035(10μM)预处理细胞1 h,可以减弱低氧诱导的POSTN上调。结果显示为平均值±s.e.m,n=3。用ImageJ.*分析蛋白质表达水平,P<0.05;**,P<0.01***,P<0.001;NS,P>0.05。
图4
图4。不同缺氧条件下HMDM细胞形态和表面标志物的变化
我们使用以下缩写来指代两种缺氧条件:N+N-U87 sup.,巨噬细胞暴露于常氧环境和常氧处理的U87细胞培养上清液;将巨噬细胞暴露于缺氧环境和低氧处理的U87细胞培养上清液中。答:。在常氧或缺氧条件下用M-CSF或GM-CSF培养7天的人类单核细胞的代表性图像。比例尺,50μm。B。使用GM-CSF在N+N-U87 sup.、N+H-U87 sup.、H+N-U87sup.或H+H-U87-sup.比例尺(50μm)存在下培养7天的人类单核细胞的代表性图像。C、。使用U251细胞上清液培养人类单核细胞也遵循相同的方案。比例尺,50μm。D。对(A)的图形分析表明,缺氧增加了用M-CSF刺激的细胞培养物中杆状巨噬细胞的比例。然而,无论细胞是否受到缺氧刺激,使用GM-CSF诱导的巨噬细胞中杆状细胞的百分比都没有显著变化。E类F、。对(B和C)的图形分析表明,缺氧环境和缺氧条件下的U87/U251细胞上清液都能增加棒状HMDM的百分比。*,P<0.05。NS,P>0.05(n=3个健康供者MDM,每组用5个字段计算,结果显示为平均值±s.e.m.,双尾配对t检验)。G-I.公司。使用流式细胞术评估暴露于(A-C)中提到的不同低氧刺激的HMDM的表型转换。表面标记物CD163被选为M2极化巨噬细胞标记物。结果来自一个典型的实验。括号中的数字表示流式细胞术分析3名患者巨噬细胞时获得的M2巨噬细胞的百分比。数据表示为平均值±标准偏差。;n=3。
图5
图5。低氧刺激后HMDMs的细胞因子分泌和基因表达
资产负债表。如图4B和4C所示,刺激人类单核细胞。第7天,使用LPS+IFN-γ刺激巨噬细胞24小时。24小时后,测定HMDM培养上清液中细胞因子IL-6、TNF-α、IL-10和CCL-22的浓度。使用U251细胞上清液培养的人单核细胞也遵循相同的程序。E。人单核细胞在常氧或缺氧条件下仅用GM-CSF或M-CSF培养7天。然后使用LPS和IFN-γ刺激细胞24小时,随后收集巨噬细胞上清液以分析细胞因子水平。F类G.公司。热图显示使用上述相同条件刺激细胞后HMDM中IL-12、IL-23、IL-1b、TGF-β、IL-1ra和CD163的基因表达。
图6
图6。ACF以HIF依赖的方式部分逆转M2巨噬细胞极化
答:。Western blot分析在常氧或缺氧条件下培养2天的U87和U251细胞中HIF-1α、TGF-α、TGF-β和POSTN水平,包括或不包括ACF。B。人单核细胞在GM-CSF或M-CSF存在下,在常氧或缺氧条件下,有无ACF培养7天。然后使用LPS+IFN-γ刺激HMDM 24小时。Western blot分析显示上述细胞中HIF-1α、M-CSFR和TGF-β水平。C、。在PBS或ACF存在的常氧/缺氧条件下生长的U87/U251细胞和THP-1巨噬细胞样细胞中分析HIF靶点Pgk-1的基因表达水平。D。在VEGF启动子的控制下,用含有萤火虫荧光素酶的质粒转染THP-1诱导的巨噬细胞和U87/U251细胞(具有三个连续的HRE序列),并在有无ACF的常氧或缺氧条件下培养,P<0.05,**,P<0.01,NS,P>0.05(n=3,平均值±标准偏差,双尾非配对t检验)。E。将ACF(3μM)或BLZ945(670 nM)或DMSO(1μL/ml)添加到人单核细胞培养基中,然后在缺氧条件下,用常氧处理的胶质瘤上清液(20%)在GM-CSF存在下培养细胞7天。第7天,用LPS+IFN-γ刺激巨噬细胞24小时,并分析上清液中的细胞因子水平。F、。人单核细胞与GM-CSF在常氧条件下在低氧处理的胶质瘤细胞上清液(H-U87/251 Sup.)、低氧处理胶质瘤细胞上清液+抗TGF-β抗体(H-U87/251 Sup.+TGF-?Ab)、ACF-预处理的低氧模拟胶质瘤细胞上层清液(ACF&H-U87/251 Sup.)存在下培养7天或低氧刺激胶质瘤细胞上清液+ACF(3μM)(H-U87/251 Sup.+ACF)。然后在培养上清液中检测细胞因子水平。G.公司。在缺氧环境+低氧处理的胶质瘤细胞上清液或缺氧环境+ACF预处理的低氧刺激胶质瘤细胞上清液+ACF(最终浓度为3μM)下,用GM-CSF培养人单核细胞7天。第7天,使用LPS+IFN-γ刺激巨噬细胞24小时。然后测定细胞因子水平。H。如上所述在(G)组中刺激HMDM的IL-12、IL-23、IL-1b、IL-1ra、TGF-β和CD163的基因表达水平。*,P<0.05,**,P<0.01,NS,P>0.05(n=3名供体,平均值±标准差,双尾配对t检验)。
图7
图7。ACF治疗限制胶质瘤进展和M2型TAM浸润
答:。注射6周后PBS或ACF治疗组动物的T2加权MRI扫描代表性图像(就地)U87单元。该线表示用于计算肿瘤体积的感兴趣区域。不同胶质瘤模型组的MRI图像中观察到的肿瘤直径的图形分析。*,P<0.05;*,P<0.01;(n=5个肿瘤,平均值±标准差,双尾非配对t检验)。B。典型的免疫荧光图像就地从不同组小鼠的动物中获取胶质瘤切片,然后对其进行POSTN(绿色)、HIF-1α(红色)和DAPI(蓝色)染色。C类D。从PBS和ACF治疗组的动物身上获得的胶质瘤中POSTN和HIF-1α表达的图形分析显示,用ACF治疗后,POSTN和HIF-1α的表达均降低。E。典型的免疫荧光图像就地从不同组的小鼠中获取胶质瘤切片,并对TAM标记物CD11b(绿色)、M2巨噬细胞标记物CD206(红色)和DAPI(蓝色)进行染色。F类G.公司。CD11b和CD206的图形分析表明,ACF处理小鼠时,TAM浸润和M2型TAM的比例均较低。H。肿瘤中CD206免疫荧光和吡莫硝唑(PIMO)染色共定位的代表性图像。比例尺:200μm。一、。对(H)的图形分析表明,经ACF治疗后,缺氧区M2-TAM浸润减少,P<0.05,**,P<0.01,NS,P>0.05(n=5个肿瘤,平均值±标准差,单因素方差分析检验)。
图8
图8。缺氧性胶质瘤区域TAM募集及其M2极化的示意图,以及ACF可能改变这两个过程的机制描述

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    1. Ohgaki H.脑肿瘤流行病学。方法分子生物学。2009;472:323–42. doi:10.1007/978-1-60327-492-014。-内政部-公共医学
    1. Ohgaki H,Kleihues P.胶质瘤的流行病学和病因。神经病理学学报。2005;109:93–108.-公共医学
    1. Charles NA、Holland EC、Gilbertson R、Glass R、Kettenmann H。脑肿瘤微环境。格利亚。2012;60:502–14.-公共医学
    1. Gordon S,Taylor PR.单核细胞和巨噬细胞异质性。Nat Rev免疫学。2005;5:953–64. doi:10.1038/nri1733。-内政部-公共医学
    1. Chang CI,Liao JC,Kuo L.巨噬细胞精氨酸酶促进肿瘤细胞生长并抑制一氧化氮介导的肿瘤细胞毒性。2001年癌症研究;61:1100–6.-公共医学

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