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.2016年9月27日；7(39):62886-62897.
doi:10.18632/目标11709。

长非编码RNA PVT1通过竞争性结合microRNA-152激活肝星状细胞

郑建坚 1 2, 于福君 三, 裴洪东 三, 吴丽梅 1, 袁章 1, 胡燕伟（Yanwei Hu） 1, 雷政 1
附属公司

长非编码RNA PVT1通过竞争性结合microRNA-152激活肝星状细胞

郑建坚等。 Oncotarget公司. .

摘要

上皮-间充质转化（EMT）过程被认为是肝星状细胞（HSC）活化的关键事件。众所周知，EMT过程需要Hedgehog（Hh）途径。据报道，长非编码RNA（lncRNAs）参与了广泛的生物过程。浆细胞瘤变异易位1（PVT1）是一种新的lncRNA，在多种人类癌症中经常上调。然而，PVT1在肝纤维化中的作用尚不明确。在本研究中，纤维化肝组织和活化的HSC中PVT1增加。PVT1的消耗减弱了体内胶原沉积。在体外，PVT1下调抑制HSC活化，包括减少HSC增殖、α-SMA和I型胶原。进一步的研究表明，PVT1敲低抑制HSC活化是通过抑制EMT过程和Hh途径实现的。Patched1（PTCH1）是Hh通路的一个负调节因子，通过PVT1敲除而增强。miR-152引起的PTCH1去甲基化是PVT1敲低对PTCH1表达的影响的原因。值得注意的是，miR-152抑制剂逆转了PVT1敲除对HSC激活的影响。荧光素酶报告试验和下拉试验表明miR-152和PVT1之间存在直接相互作用。总之，我们证明PVT1表观基因通过竞争性结合miR-152下调PTCH1的表达，促进肝纤维化的EMT过程。

关键词：DNA甲基化；病理科；microRNA-152；补丁1（PTCH1）；浆细胞瘤变异易位1（PVT1）。

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利益冲突

作者没有利益冲突需要披露。

数字

图1
图1。PVT1在肝纤维化中的上调及对HSC活化的影响在体外
答：。PVT1转录本变体示意图。颜色框显示PVT1转录物变体的外显子。黑框表示PVT1转录变体1的siRNAs。黑色箭头表示变异体中的PCR引物。值得注意的是，PVT1转录变体2的外显子1的序列与PVT1基因转录变体1的序列不同。此外，PVT1转录变体3的外显子1和外显子5的序列与PVT1基因转录变体1和2的序列不同。B。用qRT-PCR检测原发性HSC中PVT1转录变体1、PVT1基因转录变体2和PVT1蛋白转录变体3的表达。C、。通过qRT-PCR分析CCl中的PVT14老鼠。D。用qRT-PCR检测转染siPVT1的原代HSC的PVT1。E.公司。通过EdU分析测定细胞增殖。mRNAF、。和蛋白质G.公司。分析转染siPVT1的原代HSC中α-SMA和I型胶原的表达水平。GAPDH被用作内部控制*P（P）与对照组相比<0.05。每个值是三个实验的平均值±SD。
图2
图2。沉默PVT1有助于抑制CCl患者的肝纤维化4老鼠
答：。用qRT-PCR分析PVT1的相关基因表达。B。检测CCl中的羟脯氨酸水平4Ad-shPVT1治疗后的小鼠。（C和D）通过Masson染色来评估胶原的积累。比例尺，100μm。（E和F）通过蛋白质印迹法测定α-SMA和I型胶原的蛋白质水平。GAPDH被用作内部控制*P（P）与对照组和#P（P）与CCl相比<0.054组。每个值是三个实验的平均值±SD。
图3
图3。PVT1对EMT过程的影响
答：。用qRT-PCR分析E-钙粘蛋白、结蛋白和波形蛋白的mRNA水平。B。Western blotting分析E-cadherin、结蛋白和波形蛋白的蛋白水平。GAPDH被用作内部控制。C、。细胞迁移采用跨阱迁移分析。用显微镜在×100处计数横穿孔下侧的五个迁移细胞场。D。共聚焦激光显微镜检测E-cadherin（红色）、结蛋白（绿色）和波形蛋白（红色）的免疫荧光染色。DAPI染色细胞核呈蓝色。比例尺，50μm*P（P）与对照组相比<0.05。每个值是三个实验的平均值±SD。
图4
图4。PVT1对Hh通路和PTCH1启动子甲基化的影响
mRNA答：。和蛋白质B。分别用qRT-PCR和Western blotting分析PTCH1、SMO和GLI2的水平。C、。通过二硫化氢测序扩增的启动子区域的示意图。黑框表示为亚硫酸氢盐测序选择的区域。每个垂直条表示CpG二核苷酸的存在。通过二硫化氢测序检测小鼠PTCH1启动子甲基化D。和主要HSCE.公司。用siPVT1转染原代2天龄HSC 48小时，然后用miR-152抑制剂再处理48小时。DNA甲基化的平均百分比显示在每行末尾*P（P）与对照组相比<0.05。每个值是三个实验的平均值±SD。
图5
图5。miR-152参与PVT1对HSC活化的影响
用siPVT1转染原发性2天龄HSC 48小时，然后用miR-152抑制剂再处理48小时。用qRT-PCR检测原发性HSC中miR-52的水平答：。和CCl4老鼠B。.C、。通过qRT-PCR检测转染siPVT1的原代HSC中miR-152的水平。D。通过EdU分析测定细胞增殖。mRNAE.公司。和蛋白质F、。分别用qRT-PCR和Western blotting分析α-SMA、I型胶原和PTCH1的表达水平。GAPDH被用作内部控制*P（P）与对照组相比<0.05。每个值是三个实验的平均值±SD。
图6
图6。PVT1与miR-152的相互作用
答：。基于RNA22软件的PVT1中miR-152结合位点示意图。B。在miR-152模拟物或miR-NC转染后48 h，分析携带野生型或突变PVT1的荧光素酶报告子的相对荧光素素酶活性。C、。通过qRT-PCR分析转染miR-152模拟物或抑制剂的细胞中PVT1的相关基因表达。D。通过qRT-PCR分析转染siPVT1的细胞中pri-miR-152的相对基因表达。E.公司。miR-152序列的野生型和突变型示意图。F、。下拉分析验证PVT1和miR-152之间的直接相互作用。Bio-miR-NC不是PVT1的补充*P（P）与对照组相比<0.05。每个值是三个实验的平均值±SD。
图7
图7。信号通路在活化的HSC中被发现
PVT1诱导miR-152下调、PTCH1甲基化和Hh通路激活，进而促进EMT过程，有助于HSC的激活。
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