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.2016年8月26日7:12646。
doi:10.1038/ncomms12646。

在亨廷顿病模型中，VCP向线粒体募集导致线粒体吞噬损伤和神经退行性变

兴国 1, 孙晓燕 1, 狄虎 1, 王亚娟 2, 藤冈久志 三, 拉詹·维亚斯 1, Sudha查克拉帕尼 1, 阿米特·乌梅什·乔希（Amit Umesh Joshi） 4, 于洛 5, 达丽亚·莫奇利·罗森 4, 辛琪 1 6
附属公司

在亨廷顿病模型中，VCP向线粒体募集导致线粒体吞噬损伤和神经退行性变

兴国等。 国家通讯社. .

摘要

突变亨廷顿舞蹈症（mtHtt）通过引起线粒体缺陷导致亨廷顿舞蹈症（HD）的神经退行性变，但其潜在机制仍不明确。我们的蛋白质组学分析将含缬氨酸蛋白（VCP）确定为线粒体上的mtHtt结合蛋白。这里我们显示VCP选择性地移位到线粒体，在各种HD模型中，VCP与mtHtt相结合。线粒体累积的VCP引起过度的有丝分裂，导致神经细胞死亡。用肽HV-3阻断mtHtt/VCP线粒体相互作用，消除VCP向线粒体的移位，纠正过度的有丝分裂，减少HD小鼠和患者源性细胞以及HD转基因小鼠大脑中的细胞死亡。HV-3治疗可降低片段和全长mtHtt转基因小鼠HD的行为和神经病理学表型。我们的发现证明了mtHtt-诱导的VCP线粒体积累在HD发病机制中的因果作用，并表明肽HV-3可能是开发治疗HD新疗法的有用工具。

PubMed免责声明

利益冲突声明

HV-3肽抑制剂的设计和应用已申请专利。作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1。在HD模型中，VCP被招募到线粒体中。
(一)通过亲和纯化和串联质谱分析鉴定HdhQ7和HdhQ111纹状体细胞线粒体上的mtHtt-结合蛋白。显示了HdhQ111细胞线粒体上独特的mtHtt相互作用物的分子和细胞功能。VCP是mtHtt-结合蛋白的主要候选物（补充图1）。(b条)从HdhQ7和HdhQ111细胞中分离出线粒体和ER组分。用western blotting（WB）分析VCP蛋白水平。VDAC和WFS1被用作线粒体和ER的负荷控制。数据是至少三个独立实验的平均值±标准偏差。(c（c）)对照siRNA（Con）和Htt siRNA（siHTT）分别转染HdhQ7和HdhQ111细胞3天。通过WB分析测定线粒体组分中的VCP水平。VDAC是一个加载控件。数据是至少三个独立实验的平均值±标准偏差（Holm-Sidak的单向方差分析事后（post-hoc）测试）。(d日)用抗Tom20（绿色，线粒体标记物）和抗VCP（红色）抗体对HdhQ7和HdhQ111细胞进行染色。用共焦显微镜检查VCP/Tom20共定位。比例尺：10 μm。计算了皮尔逊的合作效率。每组至少统计100个细胞。数据是三个独立实验的平均值±标准偏差。(e（电子）)对线粒体上VCP进行免疫金电镜分析。比例尺：100 纳米。对标记VCP的金颗粒数量进行量化，并显示为平均值±标准偏差。对每组共30个线粒体进行计数*对与HdhQ7细胞相比<0.01。(（f）)从HD转基因小鼠R6/2（9周龄）或YAC128（6个月龄）的纹状体中分离出线粒体。n个=6只小鼠/组。VCP水平由WB（负荷控制：VDAC）测定。(克)石蜡预埋段（5 μm厚）和三名正常受试者（ID:623、624和1533）的尾状核进行抗VCP（红色）和抗Tom20（绿色）抗体免疫染色。用共焦显微镜检查线粒体上VCP的定位。计算了皮尔逊的合作效率。比例尺：10 μm。数据为平均值±标准误差(b条,d日–克)成对学生的t吨-测试。
图2
图2。VCP与线粒体上的mtHtt结合在体外和体内.
(一)用抗VCP抗体对HdhQ7和HdhQ111小鼠纹状体细胞的线粒体、ER和细胞溶质部分（Ct）进行免疫沉淀（IP），用WB分析抗VCP和抗MAB2166抗体（识别wt和mtHtt，左侧面板）或抗1C2抗体（识别mtHtt、右侧面板）的免疫沉淀。请注意，polyQ蛋白高于250 kDa显示在右侧面板中。显示了三个独立实验的代表性斑点。(b条)从6个月大的YAC128和野生型小鼠的纹状体中分离出线粒体、ER和细胞溶质部分。用抗VCP抗体进行IP，然后进行抗1C2抗体或抗EM48抗体。右侧面板显示了从YAC128小鼠纹状体分离的ER和线粒体部分的纯度。WFS1和VDAC分别标记ER和线粒体。n个=4只小鼠/组。(c（c）)从HD患者（HD1携带70个CAG重复序列，HD2携带60个CAG反复序列）和正常受试者的成纤维细胞中分离出线粒体、ER和细胞溶质部分。用抗VCP抗体进行IP，然后用抗1C2抗体进行WB。显示了两个独立实验的代表性斑点。(d日)对4名正常人和4名HD患者死后脑组织的总皮质蛋白裂解物进行IP和抗VCP抗体治疗，然后进行WB和抗1C2抗体治疗。箭头表示不检测wt-Htt的1C2抗体识别的mtHtt。注：mtHtt蛋白约82 经1C2抗体识别的kDa在HD小鼠和HD患者的皮层组织中大量存在。HD患者（HD）和正常受试者（Nor）的身份号码列在底部。HD患者（5348和5263）表现出广泛的神经元缺失和严重的脑萎缩，而HD病人（5298和5496）表现出中度神经元缺失和脑萎缩。补充图2c总结了正常受试者和HD患者的信息。正常受试者没有HD或其他神经系统疾病史。
图3
图3。HV-3肽阻断Htt/VCP结合。
(一)VCP（人类，AAI21795）和Htt（人类，NP_002102）之间的同源序列。氨基酸由一个字母的代码表示；星号（*）表示相同的氨基酸；柱（：）表示氨基酸之间的高度相似性。(b条)VCP和Htt主域的粘贴图。以相同颜色突出显示的是两种蛋白质之间的两个同源区域，即Htt中的HV-1和HV-3区域以及VCP中的相应区域HV-2和HV-4。(c（c）)HEK293细胞用具有23Q或73Q的Myc全长Htt（Myc-23Q FL或Myc-73Q FL）转染48 用HV-3或TAT（3 μM/天）。对细胞的总裂解物进行IP处理，然后用所示抗体进行WB处理。(d日)在指定的组中，对总细胞裂解物进行IP处理，然后进行WB处理。(e（电子）)重组表达和纯化的全长小鼠VCP/p97的凝胶过滤色谱图和SDS-PAGE凝胶（上）。VCP与HV-3肽在15℃滴定的平衡结合等温线 °C（较低）。每一个向下的峰值都来自于向样本细胞中单次注入HV-3。每次注射过程中的热交换是根据尖峰下的面积计算的，并符合结合等温线。K系列d日HV-3结合的n为17.9±7 μM和2.02±0.23。ΔH和ΔS的值为−2.145±0.65 千卡 摩尔−1和13.97±3.4 卡尔 摩尔−1 度−1分别是。(（f）)生物素结合HV-3或TAT（10 μM）与HD细胞或YAC128小鼠大脑的总裂解物孵育。免疫沉淀物用WB和所示抗体进行分析。上面显示的所有印迹都是三个独立实验的代表。(克)用TAT或HV-3（3 μM/天，持续3天），n个=3. (小时)YAC128或3-6个月大的野生型小鼠(我)5至9周龄的R6/2或野生型小鼠接受TAT或HV-3（3 毫克 公斤−1每天），n个=6只小鼠/组。用WB测定VCP线粒体水平。加载控制：VDAC。数据为平均值±标准误差(克–我)Holm-Sidak的方差分析事后（post-hoc）测试。
图4
图4。HV-3治疗可减少HD细胞培养中的线粒体损伤和细胞死亡。
用控制肽TAT或肽HV-3（3）处理小鼠HdhQ7和HdhQ111纹状体细胞 uM/天，持续3天）。(一)左幅：用TMRM荧光染料测定线粒体膜电位（MMP）。右图：用对照siRNA（siCon）和VCP siRNA（siVCP）转染HdhQ111细胞三天。通过TMRM测定经TAT或HV-3处理的HdhQ111细胞中的MMP。(b条)用抗Tom20抗体染色细胞，测定线粒体形态。比例尺：10 μm。量化线粒体碎片细胞占细胞总数的百分比。每组至少统计100个细胞。(c（c）)通过EM测定线粒体形态。对线粒体的长度和线粒体吞噬体的数量进行定量。每组至少有90个线粒体被计数。(d日)HD纹状体细胞被血清饥饿24小时 h.用HMGB1抗体进行IB分析，测定HMGB1在培养基中的释放。(e（电子）)HD纹状体细胞被血清饥饿24小时 h.细胞死亡由LDH的释放决定。对照组和HD患者的iPS细胞源性神经元在1 从神经元分化开始后30天开始，每天μM，持续5天。(（f）)左：神经元用抗DARPP-32和抗Tuj-1抗体染色，以显示中等棘神经元。上部：一群神经元；下部：单个神经元。比例尺：10 μm。(克)中等棘神经元轴突长度的定量。每组至少有50个神经元由一个对实验条件视而不见的观察者计数。(小时)左：MMP用TMRM荧光染料测定。右：线粒体经抗Tom20抗体染色。定量DARPP32/Tuj1-阳性神经元沿神经突的线粒体长度。(我)生长因子BDNF退出24小时诱导的神经细胞死亡 h由LDH的释放决定。所有数据均为至少三项独立研究的平均值±标准偏差。Holm-Sidak的方差分析事后（post-hoc）测试。
图5
图5。HV-3治疗可减少HD细胞培养物和HD小鼠大脑中过度的有丝分裂。
(一)用对照siRNA（con）或VCP siRNA（siVCP）处理HdhQ7和HdhQ111细胞48小时 h.分离线粒体，并通过WB测定LC3线粒体水平。典型的斑点来自三个独立的实验。线粒体上LC3 II水平的定量如右图所示。VADC被用作负载控制。(b条)Flag VCP和GFP-LC3B被共转染到野生型纹状体细胞中。36天后分离出线粒体 转染h。WB检测线粒体GFP-LC3B水平。VDAC被用作加载控制。典型的斑点来自三个独立的实验。直方图：GFP-LC3B线粒体蛋白水平的定量。用控制肽TAT或肽HV-3（3）处理HdhQ7和HdhQ111细胞 uM/天，持续3天）。(c（c）)GFP-LC3B转染HdhQ111细胞24小时 h.量化GFP-LC3B点的数量并显示在直方图中。比例尺：10 μm。(d日)用组织蛋白酶B测定试剂盒测定溶酶体组织蛋白酶B的酶活性。对照组和HD患者的iPS细胞衍生神经元在1 从神经元分化后30天开始，每天μM，持续5天。(e（电子）)用线粒体绿的荧光密度测量线粒体质量。(（f）)用Lyso-ID红色染料染色神经元，检测溶酶体活性。(克)用TAT或HV-3（3 毫克 公斤−1每天）。对9个月龄野生型和YAC128小鼠的纹状体进行了EM分析。箭头表示吞噬线粒体。直方图：每100个线粒体的数量 微米2进行了计数和量化。分析了每只动物纹状体中的15个随机区域。所有数据均为三个独立实验的平均值±标准偏差。Holm-Sidak的方差分析事后（post-hoc）测试。
图6
图6。VCP通过LIR与LC3结合，导致过度有丝分裂。
(一)为了与ATG32、FUNDC1和p62的经典LIR基序进行比较，对VCP中假定的LIR序列进行手动比对。蓝色的氨基酸表示LIR的保守核心残基。(b条)GFP-LC3B与所示质粒在HeLa细胞中共同表达。用抗GFP抗体对线粒体裂解物进行IP处理，用WB分析抗Myc和抗GFP的免疫沉淀物。典型的斑点来自三个独立的实验。(c（c）)GFP-LC3B与HeLa细胞中的指示质粒共转染。分离线粒体并用WB测定GFP-LC3B线粒体蛋白水平。数据为四项独立研究的平均值±标准误差。(d日)用所示质粒转染HeLa细胞。线粒体用抗Tom20抗体染色。通过定量Tom20免疫染色的荧光密度来确定线粒体质量。每组至少统计100个细胞。数据为三项独立研究的平均值±标准偏差。用Flag-mtVCP-WT或Flag-mt VCP-FV转染原代大鼠纹状体神经元（DIV 7）AA公司或标志mtVCP-YIAA公司质粒培养3天。(e（电子）)神经元被抗Tom20（绿色）和抗Flag（红色）抗体染色。用显微镜检查线粒体形态。(（f）)中等棘状神经元用抗DARPP-32标记（绿色）。箭头表示未转染Flag-VCP的细胞。箭头显示了具有转染的Flag VCP的细胞。(克)表达Flag-mtVCP或Flag-mt VCP-FV神经元的线粒体聚集AA公司或标志mtVCP-YIAA公司进行了量化。(小时)对表达Flag-mtVCP或Flag-mt VCP-FV的中等棘状神经元的神经形态和轴突长度进行成像AA公司或标志mtVCP YIAA公司已量化。每组至少有50个神经元由一个对实验条件视而不见的观察者计数。比例尺：10 μm。所有数据均为三个独立实验的平均值±标准偏差。Holm-Sidak的方差分析事后（post-hoc）测试。
图7
图7。HV-3治疗可减少R6/2和YAC128 HD小鼠的运动障碍。
用对照肽或肽HV-3（3 毫克 公斤−1每天，使用Alzet渗透泵皮下给药）（参见补充图5a中的治疗时间表）。(一)R6/2小鼠和野生型同窝小鼠在13周龄时的1小时整体运动活动（总行程、水平和垂直活动）由运动活动室测定(n个=每组15只小鼠）。Holm-Sidak的方差分析事后（post-hoc）测试。8至11周龄的婴儿每周进行一次尾部悬吊试验，以评估后肢扣紧情况(n个=每组15只小鼠）*对<0.05（配对学生吨-测试）。体重(b条)和生存(c（c）)记录的年龄为5-13周(n个=每组15只小鼠）*对与用控制肽TAT治疗的HD小鼠相比，<0.05。用TAT或HV-3肽对3至12个月龄的YAC128小鼠和野生型同窝小鼠进行治疗。开始治疗后每三个月测定一次小鼠行为学和HD相关病理学（见补充图中的治疗时间表第5a段）(d日) 24 在指定年龄段，用运动活动室监测YAC128小鼠和野生型同窝小鼠的一般运动时间(n个=每组15–20只小鼠）。#对与接受TAT治疗的野生型小鼠相比，<0.05*对与用TAT处理的HD小鼠相比，<0.05。(e（电子）)在指定年龄评估YAC128和野生型小鼠的Rotarod性能(n个=每组15–20只小鼠）。#对与接受TAT治疗的野生型小鼠相比，<0.05*对与接受TAT治疗的HD小鼠相比，<0.05。(b条–e（电子）)Bonferroni的重复测量双向方差分析事后的，事后的测试。所有数据均表示为平均值±标准误差。
图8
图8。HV-3治疗可减少HD小鼠的线粒体缺陷和神经病理学。
(一)通过R6/2（左）和YAC128（右）小鼠纹状体提取物的WB测定DARPP-32蛋白水平。上：代表性IB；下部：DARPP-32级别的量化直方图。肌动蛋白被用作加载控制。数据为平均值±标准误差。n个=6只小鼠/组。(b条)从TAT或HV-3处理的R6/2小鼠的背外侧纹状体获得DARPP-32免疫染色的显微照片。比例尺：100 μm。(c（c）)DARPP-32免疫密度定量。数据为平均值±标准误差。n个=6只小鼠/组。(d日)纹状体背外侧NeuN-免疫阳性细胞的定量。数据为平均值±标准误差。n个=6只小鼠/组。(一,c（c）,d日)Holm-Sidak的方差分析事后（post-hoc）测试。(e（电子）)总结方案。VCP通过与线粒体结合的mtHtt相互作用选择性地募集到线粒体。线粒体累积的VCP作为一种有丝分裂适配器，通过LC3相互作用区（LIR基序）与自噬体成分LC3结合。因此，mtHtt-诱导的VCP与线粒体结合导致过度的线粒体吞噬，从而导致线粒体质量损失、线粒体功能障碍和神经细胞死亡。通过选择性肽HV-3阻断线粒体上mtHtt与VCP的结合，抑制VCP线粒体的积累，从而减少过度的有丝分裂和随后的神经元变性。因此，在HD培养物和HD动物中使用HV-3治疗可降低HD相关神经病理学。
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