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.2016年10月11日；7(41):66970-66988.
doi:10.18632/目标11408。

对ATG4B抑制敏感的乳腺癌细胞亚型的鉴定

斯维特兰娜·博特尼克 1 2, 考特尼·乔特卡 1 三, 雨果·霍林斯 4 5 6, 梁朝伟（Samuel Leung） 4 5, 詹妮弗·H·贝克 7, 钱德拉·勒博维茨 1 三, 维斯拉瓦·德拉戈斯卡 8, 南希·E·戈 1, 马塞尔·巴利 8 9 4 10, 安德鲁·明钦顿 7, 凯伦·A·盖尔蒙 11 12, 莎伦·戈尔斯基 1 2 三 13
附属公司

对ATG4B抑制敏感的乳腺癌细胞亚型的鉴定

斯维特兰娜·博特尼克等。 Oncotarget公司. .

摘要

自噬是一种溶酶体介导的降解和再循环过程，在晚期恶性肿瘤中发挥作用，促进癌细胞存活，促进癌症进展和耐药性。虽然各种自噬抑制策略在癌症治疗中正在研究中，但这些自噬抑制剂的相应患者选择标准需要制定。由于半胱氨酸蛋白酶ATG4B在自噬过程中起着核心作用，因此它是一种潜在的治疗靶点。在这项研究中，我们研究了ATG4B在乳腺癌中的表达，乳腺癌是一种由几个分子亚型组成的异质性疾病。我们检测了一组乳腺癌细胞系、异种移植瘤和乳腺癌患者标本的ATG4B蛋白表达，发现HER2和ATG4B蛋白表达之间存在正相关。我们发现HER2阳性细胞而非HER2阴性乳腺癌细胞需要ATG4B才能在压力下存活。在HER2阳性细胞中，在饥饿和HER2抑制条件下，细胞保护性自噬依赖于ATG4B。siRNA联合敲除ATG4B和HER2导致细胞活力显著降低，与单独使用曲妥珠单抗治疗相比，在曲妥珠抗敏感和耐药HER2过度表达的乳腺癌细胞中，ATG4B敲除与曲妥珠单抗联合使用导致细胞活力大幅降低。这些结果共同证明了ATG4B阳性表达与HER2阳性乳腺癌的新关联，并表明该亚型适用于新出现的ATG4B抑制策略。

关键词：ATG4B；HER2；自噬；乳腺癌；曲妥珠单抗。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突

没有披露潜在的利益冲突。

数字

图1
图1。ATG4B蛋白表达与HER2状态相关
答：。与HER2阴性细胞系相比，HER2阳性细胞系的ATG4B蛋白水平较高。典型的western blot分析显示ATG4B在HER2阳性（n=5）和HER2阴性（n=6）乳腺癌细胞系中的基本表达。条形图显示了各组细胞系（平均值±SEM）中ATG4B的平均表达，这些细胞系归一化为肌动蛋白（用作蛋白质负荷的内部控制）；n=3；P（P）值基于学生的t吨-测试。B。MCF7和MDA-MB-231-BR-eGFP乳腺癌细胞中HER2+过度表达导致ATG4B蛋白水平升高。典型的western blot和条形图显示ATG4B表达与肌动蛋白负荷控制标准化（平均值±SEM；n=3）；P（P）值基于学生的t吨-测试。C、。三种HER2过度表达细胞系（SKBR3、MDA-MB-453和JIMT1）中HER2的敲除导致ATG4B蛋白水平降低、LC3B-II增加和SQSTM1/p62表达降低。来自3个独立实验的代表性western blot。右边的条形图显示了根据肌动蛋白负荷控制标准化的ATG4B表达；（平均值±SEM；n=3）；P（P）数值基于Dunnett后验的单向方差分析。
图2
图2。HER2状态与自噬活性呈负相关
答：。HER2过度表达细胞降低了基础自噬水平。使用饱和（60nM）浓度的Bafilomycin A1（Baf A1）进行的Western blot通量分析显示，与HER2过度表达的MCF7细胞相比，亲本MCF7中的LC3B-II和p62水平。右侧的条形图显示了LC3B-II（在Baf A1存在的情况下）和p62的表达，标准化为肌动蛋白负载控制（倍数变化）；平均值±SEM；n=3；P（P）这些值基于Student的t检验。B。HER2基因敲除增加自噬通量。稳定表达mRFP-EGFP-LC3B蛋白的SKBR3细胞在喂食和饥饿条件下用HER2或打乱siRNA处理。红点（自溶体）相对于黄点（自噬体）的增加表明HER2基因敲除导致自噬流量增加。条形图显示了每个细胞红点与黄点的平均比率（平均值±SEM）。数据收集自3个独立实验P（P）数值基于Dunnett后验的单向方差分析。比例尺，50μm。C、。HER2基因敲除增加自噬通量。使用饱和（60nM）浓度的Bafilomycin A1（Baf A1）进行的Western blot通量分析显示，与干扰siRNA对照相比，HER2 siRNA处理的细胞中的LC3B-II、p62和ATG4B水平。右边的条形图显示LC3B-II（在Baf A1存在的情况下）、p62和ATG4B表达，归一化为肌动蛋白负载控制（折叠变化）；平均值±扫描电镜；n=3；P（P）这些值基于Student的t检验。
图3
图3。ATG4B是HER2阳性细胞增加自噬流量和饥饿生存所必需的
答：。ATG4B敲除导致自噬抑制。使用饱和浓度的Bafilomycin A1（Baf A1）进行的Western blot通量分析显示，在喂食和饥饿条件下，ATG4B敲除后HER2+MCF7细胞中LC3B-II和p62水平。右侧条形图显示LC3B-II（在Baf A1存在下）和p62表达，归一化为肌动蛋白负载控制（折叠变化）；平均值±SEM；n=3；P（P）这些值基于Student的t检验。B。ATG4B基因敲除可防止HER2阳性细胞因饥饿而增加自噬流量。稳定表达mRFP-EGFP-LC3B蛋白的SKBR3细胞在喂养和饥饿条件下用ATG4B或加扰siRNA处理。条形图显示了每个细胞红点与黄点的平均比率（平均值±SEM）。数据由3个独立实验计算得出P（P）数值基于Dunnett后验的单向方差分析。比例尺，50μm。C、。HER2过度表达细胞在饥饿状态下对ATG4B抑制敏感。HER2阴性细胞（MDA-MB-231、SUM159PT、Hs578T和MCF7）和HER2阳性细胞（SKBR3、MDA-MB-453、JIMT-1和HER2+MCF7。通过590nm（A590）处的吸光度测量保留结晶紫染色，以生成增殖指数。条形图显示了3个独立实验的平均±SEM值，这些实验归一化为馈电干扰控制。P（P）数值基于Dunnett后验的单向方差分析。D。饥饿状态下ATG4B的敲除导致HER2过度表达细胞中caspase依赖性细胞死亡。使用基于发光（RLU，相对发光单位；y轴）的caspase-Glo分析法对SKBR3、MDA-MB-453、JIMT-1和HER2+MCF7细胞进行caspase-3/7活性诱导分析。条形图显示了3个独立实验的平均±SEM值。使用环己酰胺（CHX）作为胱天蛋白酶激活的阳性对照。P（P）数值基于Dunnett后验的单向方差分析。
图4
图4。ATG4B以及ATG4C和ATG4A有助于HER2基因敲除后自噬通量的增加
答：。ATG4B和HER2联合敲除导致HER2阳性细胞的自噬通量抑制。稳定表达mRFP-EGFP-LC3B蛋白的SKBR3细胞在喂食和饥饿条件下用HER2和ATG4B siRNA（ATG4B-siRNA1，中心；ATG4B-siRNA2，右）或打乱siRNA（对照，左）处理。条形图显示了每个细胞红点与黄点的平均比率（平均值±SEM）。所示数据来自3个独立实验，以及P（P）数值基于Dunnett后验的单向方差分析。比例尺，50μm。B。HER2敲除导致ATG4B水平下降，而ATG4B和ATG4B+HER2敲减导致ATG4 B水平进一步下降。典型的western blot分析显示，ATG4B和HER2单独或联合敲除后，SKBR3-tfLC3B细胞中的ATG4B水平。C、。HER2基因敲除导致ATG4A、ATG4C和ATG4D水平降低。代表性的（n=2）蛋白质印迹分析显示HER2敲低后SKBR3-tfLC3B细胞中的ATG4A、ATG4C和ATG4D水平。D。HER2基因敲除后，需要ATG4C（在喂食和饥饿条件下）和ATG4A（仅在饥饿情况下）进行自噬诱导。稳定表达mRFP-EGFP-LC3B蛋白的SKBR3细胞在喂食和饥饿条件下分别用ATG4A、ATG4C、ATG4 D或打乱siRNA单独或与HER2 siRNA联合处理。条形图显示了每个细胞红点与黄点的平均比率（平均值±SEM）。所示数据来自3个独立实验，以及P（P）数值基于Dunnett后验的单向方差分析。比例尺，10μm。
图5
图5。ATG4B敲除使HER2阳性细胞对HER2抑制敏感
答：。和B。ATG4B是HER2抑制下细胞存活所必需的。与喂食和饥饿条件下的单一敲除相比，联合敲除ATG4B和HER2导致细胞活力降低。阿拉马蓝（A）和台盼蓝排除（B）试验用于评估siRNA处理后的细胞活力。条形图表示相对于饲喂的加扰对照的%活细胞的平均±SEM值（n=3个独立实验）。P（P）数值基于Dunnett后验的单向方差分析。C、。曲妥珠单抗（Tz）治疗导致自噬流量增加，ATG4B水平降低。SKBR3-tfLC3、MDA-MB-453和JIMT-1细胞的代表性蛋白质印迹。右边的条形图显示LC3B-II（在Baf A1存在的情况下）、p62和ATG4B表达，归一化为肌动蛋白负载控制（折叠变化）；平均值±SEM；n=3；P（P）这些值基于Student的t检验。D。ATG4B敲除使HER2阳性细胞对曲妥珠单抗（Tz）敏感。SKBR3、MDA-MB-453和JIMT-1细胞用ATG4B和干扰siRNAs预处理，然后用曲妥珠单抗处理72小时。用结晶紫染色法观察菌落（左侧）。用A590测量保留结晶紫染色以生成增殖指数（中央面板）。条形图显示来自3个独立实验的平均±SEM值，这些实验标准化为扰乱siRNA对照。P（P）数值基于Dunnett后验的单向方差分析。伴随ATG4B水平的代表性western blot分析，以及使用Bafilomycin A1（Baf A1）饱和浓度的LC3B-II水平通量分析，如右图所示。
图6
图6。ATG4B水平与HER2状态和曲妥珠单抗治疗相关体内
答：。免疫组织化学图像显示患者乳腺肿瘤ATG4B表达阳性和阴性。B。曲妥珠单抗在乳腺癌异种移植物中的分布呈剂量依赖性。携带BT-474异种移植瘤的小鼠接受4、10或20 mg/kg剂量的曲妥珠单抗8小时或每72小时10 mg/kg，持续一周，最后一次给药24小时后收集组织。用荧光标记的抗人二级抗体在肿瘤冷冻切片中标记结合曲妥珠单抗；代表性切片显示为曲妥珠单抗（洋红色）、CD31（深蓝色）和灌注染料DioC7（3）（青色）。比例尺，150μm。C、。曲妥珠单抗治疗导致BT-474肿瘤异种移植物中ATG4B蛋白表达以剂量依赖性方式降低。用western blot分析评估上述实验（B组）中肿瘤中的ATG4B和肌动蛋白水平。条形图显示每个治疗组内平均ATG4B表达（平均值±SEM）归一化为肌动蛋白（用作蛋白质负荷的内部对照）；P（P）值基于学生的t检验。D。单剂量10mg/kg曲妥珠单抗治疗24小时后收集的曲妥珠单抗在JIMT1异种移植瘤中的分布。用荧光标记的抗人二级抗体在肿瘤冷冻切片中标记结合曲妥珠单抗；图中显示了具有代表性的部分，其中包括曲妥珠单抗（洋红色）、CD31（深蓝色）和灌注染料DioC7（3）（青色）。比例尺，150μm。E.公司。曲妥珠单抗治疗导致JIMT1肿瘤异种移植物中ATG4B蛋白表达降低。用western blot分析检测肿瘤组织中ATG4B和肌动蛋白水平。条形图显示每个治疗组内平均ATG4B表达（平均值±SEM）归一化为肌动蛋白（用作蛋白质负荷的内部对照）；P（P）值基于学生的t检验。
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