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.2016年11月；65(11):3396-3409.
doi:10.2337/db16-0136。 Epub 2016年8月23日。

小鼠脂肪特异性富马酸水合酶缺乏对肥胖、肝脂肪变性和胰岛素抵抗的保护作用

郝阳 1 2, 姜伟武 2, Shu P Wang（王树平） 2, 伊莱妮亚·塞韦里 三, 洛丽斯·萨蒂尼 三, 诺玛·弗里泽尔 4, 萨维里奥·辛蒂 三, 公社杨 5, 格兰特·米切尔 6
附属公司

小鼠脂肪特异性富马酸水合酶缺乏对肥胖、肝脂肪变性和胰岛素抵抗的保护作用

郝阳等。 糖尿病. 2016年11月.

摘要

肥胖和2型糖尿病与脂肪组织线粒体功能受损有关。为了研究脂肪线粒体能量代谢原发性缺乏的影响，我们建立了富马酸水合酶（FH）（一种完整的克雷布斯循环酶）脂肪特异性缺乏的小鼠（AFHKO小鼠）。AFHKO小鼠线粒体超微结构严重异常，白色脂肪组织（WAT）和棕色脂肪组织ATP耗竭，WAT质量低，脂肪细胞小，大的单房棕色脂肪细胞产热受损。AFHKO小鼠在衰老和高脂肪喂养的情况下，对肥胖、胰岛素抵抗和脂肪肝具有强大的保护作用。AFHKO白色脂肪细胞显示出正常的脂肪分解，但低甘油三酯合成。线粒体毒素导致的正常白色脂肪细胞中的ATP耗竭也会减少甘油三酯的合成，与ATP耗竭成比例，这表明甘油三酸酯合成减少可能是脂肪细胞能量缺乏的非特定原因。在热中性时，胰岛素抵抗和肝脂肪变性的保护作用减弱。综上所述，结果表明，在常规动物房条件下的冷应激下，小鼠脂肪细胞特异性FH缺乏会导致脂肪组织线粒体能量耗竭，并可防止肥胖、肝脂肪变性和胰岛素抵抗，这表明在冷应激动物中，脂肪组织中的线粒体功能是脂肪量和胰岛素敏感性的决定因素。

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数字

图1
图1
AFHKO小鼠脂肪特异性FH基因切除。A类：实时PCR检测性腺周围WAT和BAT中FH mRNA的表达(n个= 8).B类和C类：FH的Western blot。线粒体是从性腺周WAT和AFHKO和对照小鼠BAT的分离脂肪细胞（10μg线粒体蛋白/通道）中制备的(B类). 非二糖组织中FH的表达（30μg组织匀浆蛋白/车道）(C类).D类和E类：性腺周围WAT和BAT的FH活性和富马酸含量(n个= 6).F类：富马酸血浆（5个月大的雄性，n个= 8).G公司：5个月龄对照组和AFHKO小鼠性腺周WAT和BAT的典型线粒体超微结构(n个=5）。H（H）：OXPHOS复合物的蓝色天然PAGE分析。WAT使用15微克线粒体蛋白，BAT使用7.5微克线粒体蛋白质(n个＝4，显示了两个具有代表性的结果）。我——我：性腺周WAT:ATP含量(n个= 6) (我)，CS活动(n个= 6) (J型)，mtDNA含量(n个= 8) (K（K）)线粒体功能相关基因的表达水平(n个= 8) (我).M（M）——P（P）：面板中评估的BAT我——我在同一只老鼠的样本中*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ***P（P）< 0.001. bm，基底膜；C、 控制；gDNA，基因组DNA；一、 复合物I；二、 复合物II；三、 复合体III；四、 复合物IV；KO、AFHKO；五十、 脂滴；m、 线粒体；巨大线粒体；pv，胞饮小泡；SKM，骨骼肌；TF，转录因子；五、 复合物V。
图2
图2
AFHKO小鼠对衰老诱导的肥胖有保护作用。A类和B类：男性生长至10个月大(A类)和女性(B类)正常饮食喂养的对照组和AFHKO小鼠(n个= 12).C类：5个月大时的身体成分(n个=10）。脂肪百分比是指脂肪质量占总（瘦肉+脂肪）质量的一部分。D类：5个月大的对照组和AFHKO雄性大鼠的WAT仓库质量和BAT质量。E类：喂食正常饮食的5个月大对照和AFHKO小鼠的代表性苏木精-伊红染色WAT和BAT切片。比例尺=100μm。F类：性腺周围WAT中白色脂肪细胞直径的分布(n个= 5; ≥测量315个细胞/小鼠）。G公司：脂肪细胞平均直径。H（H）：10个月大时的身体成分(n个= 8). *P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ***P（P）< 0.001. BAT，肩胛间BAT；Mes，肠系膜；PG，性腺周围；PR，肾周；SC，皮下。
图3
图3
FH缺乏改变WAT和BAT的基因表达模式不同。A类——C类,G公司、和H（H）：性腺周WAT。与葡萄糖摄取相关的转录本(A类)、糖酵解(B类)、脂肪生成和TG合成(C类)，与脂质能量代谢相关的转录因子(G公司)和线粒体脂肪酸氧化(H（H）)通过实时PCR检测。研究的脂肪组织来自5个月大的雄性对照小鼠和AFHKO小鼠(n个= 8).D类——F类,我、和J型：根据性腺周WAT评估BAT。K（K）和我：WAT和BAT中指示蛋白质的蛋白质印迹(n个=4，显示两个代表性结果）*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ***P（P）< 0.001. C、 控制；KO、AFHKO。
图4
图4
FH缺乏减少白色脂肪细胞中TG的合成，允许正常刺激脂肪分解，并损害温度维持。A类：在隔离性腺周围白色脂肪细胞中评估TG合成，如研究设计和方法(n个= 6–7).B类：ATP耗竭和TG合成减少之间的相关性（性腺周围脂肪细胞，5个月大的小鼠，n个= 6).C类：禁食5小时和48小时时的血浆NEFA水平（5个月大的男性，n个= 9).D类：注射生理盐水或β3-肾上腺素能特异性激动剂CL 316243后NEFA水平的变化。小鼠禁食5h，然后腹腔注射生理盐水或生理盐水中的CL 316243。在注射前和注射后15分钟采集尾静脉血样用于NEFA测定（5个月大的雄性，n个= 12).E类：禁食4小时后体温为4°C（4个月大的雄性，n个= 12).F类：禁食5小时和48小时后，体温为21°C（5个月大的雄性，n个= 9).G公司：BAT中与生热相关的转录物（5个月大的雄性，n个= 8).H（H）：通过Western blot测量对照组和AFHKO小鼠（5个月大的雄性，30μg蛋白质/车道）BAT中UCP1蛋白的表达*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ***P（P）< 0.001. 蚂蚁，抗霉素A；CL，CL 316243；NS，不显著；Olig，寡霉素；腐烂、鱼藤酮；Tm，温度。
图5
图5
AFHKO小鼠随着年龄增长仍然对胰岛素敏感。A类：3.5月龄小鼠的ITT（顶部）和GTT（底部）。对于ITT，在6:00取下食物后5小时上午。，腹腔注射胰岛素（1单位/kg），并在指定时间测量血糖(n个= 8). 对于GTT，在6:00取下食物后14小时下午。，腹腔注射1.5 g/kg葡萄糖(n个= 8).B类：在10个月大的小鼠中进行ITT（顶部）和GTT（底部），同时遵循面板中描述的方案A类(n个= 6–8). 插图描述了曲线下的面积（AUC），单位为mmol/L·min。C类和D类：在禁食5小时的5月龄和10月龄小鼠中测量胰岛素、瘦素、TG、NEFA和脂联素的血浆水平(n个= 7–11).E类——G公司：注射胰岛素或生理盐水（禁食4小时，注射1单位/kg胰岛素）15分钟后，用磷酸化Akt（Ser 473）（pAkt）或总Akt抗体（10个月大的小鼠，n个= 3–4; 显示了两个具有代表性的结果）*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ***P（P）< 0.001. C、 控制；KO、AFHKO。
图6
图6
AFHKO小鼠对高脂饮食（HFD）诱导的肥胖和肝脂肪变性具有抵抗力，对胰岛素敏感，并且具有葡萄糖耐受性。A类：HFD上的体重变化。从9周龄开始给对照和AFHKO雄性小鼠喂食HFD（9只对照，10只AFHKO）。B类：身体成分（5个月大的小鼠，n个= 7).C类：18周龄时ITT（顶部）和19周龄时GTT（底部）(n个= 6). 插图描述了曲线下的面积（AUC），单位为mmol/L·min。D类：胰岛素、瘦素、TG、NEFA和脂联素的血浆水平(n个= 6–8).E类：从9周龄开始，5个月大的小鼠在正常饮食（CD）或HFD喂养后的典型肝脏组织学(n个= 3). 比例尺=100μm。F类和G公司：肝脏肿块(n个=8）和肝脏TG含量(n个= 6–8). *P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ***P（P）< 0.001.
图7
图7
热中性逆转AFHKO小鼠的胰岛素敏感性并降低其对肝脂肪变性的抵抗力。A类：ITT（顶部）和GTT（底部）在21°C下进行（9个月大的小鼠，n个= 8).B类：转移至热中性（30°C）1个月后，这些小鼠的ITT（顶部）和GTT（底部）。插图描述了曲线下的面积（AUC），单位为mmol/L·min。C类——E类：肝脏组织学（显示三个有代表性的断面）、肝脏肿块(n个=8）和肝脏TG含量(n个=8）分别是在21°C下饲养的10月龄小鼠和在21°C下饲养的9月龄小鼠，然后在30°C下放置1个月。比例尺=100μm。F类——我：在热中性状态下1个月前后的胰岛素、瘦素、NEFA和脂联素血浆水平（10月龄小鼠，n个= 8). *P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ***P（P）< 0.001.
图8
图8
脂肪FH缺乏的影响。FH缺乏会破坏Krebs循环，导致线粒体超微结构改变和ATP水平降低，从而导致严重的线粒体功能障碍。AFHKO小鼠WAT中脂肪FH缺乏导致TG合成能力降低、细胞直径变小、脂肪量低和基础血浆NEFA低。在BAT中，AFHKO小鼠的UCP1表达显著下降，棕色脂肪细胞肥大，产热能力下降。在正常室温（21°C）下，这些AFHKO小鼠很瘦，可以抵抗肝脏脂肪变性和胰岛素抵抗。FAO，脂肪酸氧化；富马酸、富马酸盐；苹果酸；RC，呼吸链。
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