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.2016年8月22日；11（8）：e0161396。
doi:10.1371/journal.pone.0161396。 2016年eCollection。

前蛋白转化酶Furin通过促进血管生成、迁移和侵袭促进横纹肌肉瘤恶性化

帕特里夏·贾克斯 1 2, 瓦伦蒂娜·达莱桑德罗 1 2, 尼科尔·格罗布 1 2, 西纳·比埃尔 1 2, 卡塔琳娜·哈丁 1 2, 击败W Schäfer 1 2, 米歇尔·贝纳斯科尼 1 2
附属公司

前蛋白转化酶Furin通过促进血管生成、迁移和侵袭促进横纹肌肉瘤恶性化

帕特里夏·贾克斯等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

前蛋白转化酶（PC）furin裂解前体蛋白，这是许多癌症相关蛋白活化的重要步骤。呋喃和呋喃样PC的底物在增殖、转移和侵袭中发挥作用。其中一些与儿童软组织肉瘤横纹肌肉瘤（RMS）的进展有关。在本研究中，我们发现PC，尤其是furin，在RMS细胞系中表达。为了研究弗林蛋白酶的功能作用，我们产生了具有调节弗林蛋白酶活性的RMS细胞系。弗林蛋白酶的沉默或稳定抑制延缓了体内Rh30和RD异种移植物的肿瘤生长，并与较低的微血管密度相关。furin活性降低还降低了体外迁移和侵袭能力，抑制RMS细胞中的furin减少了IGF1R、VEGF-C、PDGF-B和MT1-MMP的处理，导致成熟蛋白水平降低。此外，我们发现，在RMS细胞中适当的IGF信号需要furin活性，因为furin沉默导致IGF1刺激后Akt磷酸化降低。总之，我们的结果表明，呋喃通过激活参与肿瘤生长、血管化、转移和侵袭的蛋白质，在RMS细胞的恶性表型中发挥重要作用。

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数字

图1
图1。Furin在横纹肌肉瘤（RMS）细胞系中高度表达。
A） 用qRT-PCR方法检测了5株尤因肉瘤、8株骨肉瘤和20株横纹肌肉瘤细胞系中所有9种前蛋白转化酶（PC）的mRNA水平。所示为相对于GAPDH表达的水平。B） 通过免疫印迹法评估20个不同RMS细胞系中的前体和成熟furin蛋白水平。C） 所选RMS细胞系的内源性furin活性：Rh36、RD（eRMS）、Rh3、Rh4、Rh30、Rh41和RMS13（aRMS）。Furin活性缺陷细胞LoVo细胞作为阴性对照。在抗呋喃抗体涂层板上从细胞裂解物中捕获呋喃，6h后通过添加荧光底物Boc-RVRR-AMC测定呋喃活性。显示的是通过背景减法归一化的值。
图2
图2。稳定调节呋喃的RMS电池的生成和验证。
用pcDNA3.1（+）全长furin（fur）或α1-AT Portland（pdx）稳定转染Rh30和RD细胞。shRNA慢病毒颗粒用于稳定的呋喃沉默（shFA，shFE）。A） 通过qRT-PCR定量Furin mRNA水平。表达水平标准化为GAPDH和相应对照细胞的furin表达（空载体或打乱的shRNA）。B） 用抗体MON-152免疫印迹法评估稳定Rh30和RD细胞系中furin蛋白的水平。C） furin过度表达或沉默细胞系中furin活性的评估。结果在日志上的各个wt单元上进行了标准化10比例尺。数据代表三个独立的实验。所示为平均值±SD。双向方差分析，p<0.05。
图3
图3。Furin活性与肿瘤生长和微血管密度呈正相关。
将500万稳定调节furin活性的RMS细胞皮下注射到NOD/Scid IL2reg中-/-并随时间监测肿瘤生长。A） aRMS Rh30异种移植物中的肿瘤生长。肿瘤平均需要20-35天才能达到500mm的大小3每组由6只小鼠组成。B） eRMS RD异种移植物中的肿瘤生长。肿瘤平均需要7-19周才能达到500毫米的大小3每组由10只小鼠组成。C） Rh30异种移植物微血管密度的组织学分析。当肿瘤大小达到200–400 mm时收集肿瘤3切片进行CD31免疫荧光染色。蓝色：核DAPI染色。显示代表性图片（放大倍数：10倍）。D） Rh30肿瘤中的微血管密度以每毫米血管数进行评估2图中显示了每张图片的平均量化。描述为RD肿瘤微血管密度的组织学分析的平均值±SD。在终点收集肿瘤，石蜡切片进行furin和H&E染色。显示有代表性的图片（放大10倍）。F） RD肿瘤中的微血管密度以每毫米血管数进行评估2。每节三张图片，共一节。该图显示了每张图片的平均量化。所示为平均值±SD。
图4
图4。furin活性影响RMS细胞的迁移和侵袭。
A） 呋喃活性对伤口愈合的影响。具有稳定调节呋喃活性的Rh30和RD细胞用于划痕试验。分别在0h、4h、16h和24h拍摄照片，并使用TScratch程序在0h内评估伤口愈合情况。描述为平均值±SD。B）呋喃活性对RMS细胞侵袭性的影响。Rh30和RD细胞（wt、fur、pdx、shFA和shFE）分别在荧光标记明胶涂层的8腔载玻片上培养24h和48h。在细胞电镀前16小时，开始使用50μM的pan-PC抑制剂癸酰基-RVKR-氯甲基酮（CMK）进行处理。使用ImageJ程序，根据荧光明胶的降解情况，拍摄免疫荧光照片并计算侵袭率。所示为平均值±SD。学生t检验，p<0.05，p<0.01，p<0.005***。
图5
图5。在RMS细胞中，furin底物的成熟和IGF1R信号依赖于furin活性。
A） 用pan-PC抑制剂CMK处理后呋喃底物的成熟。用50μM CMK处理Rh30和RD细胞16h，并通过免疫印迹检测弗林底物IGF1Rβ、VEGF-C、PDGF-BB和MT1-MMP的成熟状态。B） IGF1Rβ在Rh30和RD细胞系中的成熟。通过免疫印迹法分析稳定Rh30和RD细胞系（wt、fur、pdx、shFA和shFE）中前体和成熟IGF1Rβ的水平。C） 短暂性呋喃沉默后RD细胞中的IGF信号转导。用对照（scr）或抗furin siRNA（siFur1和siFur2）瞬时转染RD细胞，转染24小时后开始血清饥饿。转染后48小时用50 ng/mL IGF1刺激细胞10分钟，并通过免疫印迹法评估IGF1Rβ的成熟状态和Akt（Ser473）的磷酸化。
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赠款和资金

这项工作得到苏黎世州癌症联盟的支持(网址：www.krebsligazuerich.ch); 朱利叶斯·穆勒zur Unterstützung der Krebsforschung基金会；以及由Krebsbbekämpfung基金会（Grant 255，网址：www.krebsbekaempfung.ch). 资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。