Reprogramming of Normal Fibroblasts into Cancer-Associated Fibroblasts by miRNAs-Mediated CCL2/VEGFA Signaling

doi:10.1371/journal.pgen.1006244

.2016年8月19日；12（8）：e1006244。

doi:10.1371/journal.pgen.1006244。 eCollection 2016年8月。

miRNAs介导的CCL2/VEGFA信号转导正常成纤维细胞重编程为癌相关成纤维细胞

华深^1 2, 余小波^三, 杨凤鸣^1 2, 张志华⁴, 沈建新⁵, 金孙⁶, 斯瓦蒂·乔克西⁷, Siriporn Jitkaew公司⁸, 《永乾书》^1 2

附属公司

¹南京医科大学第一附属医院肿瘤科，江苏省南京市。
²中国江苏省南京市南京医科大学肿瘤生物标志物与防治江苏省重点实验室，肿瘤个性化医学协同创新中心。
^三上海交通大学上海总医院胸外科，上海，中国。
⁴河北省张家口市河北北方大学第一附属医院呼吸科。
⁵河北北方大学第一附属医院临床检验科，中国河北省张家口市。
⁶南京医科大学附属第一医院核医学系，中国江苏省南京市。
⁷美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院。
⁸泰国曼谷朱拉隆功大学联合健康科学学院临床化学系。

PMID： 27541266
预防性维修识别码： PMC4991802型
内政部： 10.1371/journal.pgen.1006244

miRNAs介导的CCL2/VEGFA信号转导正常成纤维细胞重编程为癌相关成纤维细胞

华深等。公共科学图书馆-基因. 2016.

.2016年8月19日；12（8）：e1006244。

doi:10.1371/journal.pgen.1006244。 eCollection 2016年8月。

作者

华深^1 2, 余小波^三, 杨凤鸣^1 2, 张志华⁴, 沈建新⁵, 金孙⁶, 斯瓦蒂·乔克西⁷, Siriporn Jitkaew公司⁸, 《永乾书》^1 2

附属公司

¹南京医科大学第一附属医院肿瘤科，江苏省南京市。
²中国江苏省南京市南京医科大学肿瘤生物标志物与防治江苏省重点实验室，肿瘤个性化医学协同创新中心。
^三上海交通大学上海总医院胸外科，上海，中国。
⁴河北省张家口市河北北方大学第一附属医院呼吸科。
⁵河北省张家口市河北北方大学第一附属医院临床实验室。
⁶南京医科大学附属第一医院核医学系，中国江苏省南京市。
⁷美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院。
⁸泰国曼谷朱拉隆功大学联合健康科学学院临床化学系。

PMID： 27541266
预防性维修识别码： PMC4991802型
内政部： 10.1371/journal.pgen.1006244

摘要

癌相关成纤维细胞（CAFs）是肿瘤造口最常见的组成部分，已知可促进肿瘤的发生、发展和转移。然而，癌细胞如何将正常成纤维细胞（NF）转化为CAF的机制尚不清楚。在本研究中，我们确定了miRNAs在NF转化为CAF中的作用。我们发现，与匹配的NF相比，miR-1和miR-206在肺CAF中表达下调，而miR-31在肺CAFs中表达上调。重要的是，修改这三种解除调控的miRNAs的表达可以诱导NF向CAF的功能转换，反之亦然。当miRNA-重新编程的NF和CAF与肺癌细胞（LCCs）共同培养时，在两组之间观察到类似的细胞因子表达谱模式。通过结合细胞因子表达谱和miRNAs算法，我们分别将VEGFA/CCL2和FOXO3a确定为miR-1、miR-206和miR-31的直接靶点。重要的是，系统输送抗VEGFA/CCL2或前miR-1、前miR-206和抗miR-31可显著抑制肿瘤血管生成、TAM积聚、肿瘤生长和肺转移。我们的研究结果表明，miRNAs介导的FOXO3a/VEGF/CCL2信号在LCCs介导的NF进入CAF中发挥着重要作用，这可能对未来提供新的肺癌生物标志物和潜在的治疗靶点具有临床意义。

PubMed免责声明

利益冲突声明

提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

**图1。与NF相比，CAF中解除管制的miRNAs的鉴定。**
（A）热图显示三对CAF和匹配的健康NF中前20个显著解除调控的miRNAs水平。红色，上调；蓝色，下调。重点介绍了两种下调程度最高的miRNA和一种上调程度最高的miRNA。（B）采用Taqman qRT-PCR法测定21例肺癌患者和21例健康人的血浆miR-1、miR-206和miR-31水平。实验一式三份，每次重复三次。（C）表达RFP的LCC与NF共培养10天。共培养NF是流动分类的。通过Taqman qRT-PCR测定NFs、共培养NFs（与A549或H460）和CAFs细胞中miR-1、miR-206和miR-31的水平，并将其归一化为U6水平。（D） LCC是在博伊登舱室顶部播种的。计算腔室内侧共培养细胞（A549/H460+NFs、A549/H460+共培养NFs或A549/Hz 460+CAFs）在条件培养基（CM）作用下通过无涂层过滤器迁移的细胞数量，并将其归一化为LCCs。每个场的平均细胞数由三个重复井中的三个场确定*与NFs+LCC共培养相比，p＜0.05、**p＜0.001。（E）将LCC与琼脂糖混合并播种到6孔板中。将CM培养基添加到井中，每两天更换一次。培养12天后，菌落用100%甲醇固定15分钟，并用0.1%结晶紫染色。计数直径大于1.5mm的菌落。实验重复三次**p<0.001 vs NFs+LCCs共培养。

**图2。miR-1、miR-206和miR-31在NFs和CAFs中的功能作用。**
（A，B）NFs用抗miR-1、抗miR-206和前miR-31（NFs-TM）三重转染，或CAF用前miR-1，前miR-206和抗miR-31三重转导。进行细胞迁移实验以评估LCC对来自共培养细胞的CM的迁移效率（A）。当与NFs-Scr、NFs-TM、CAFs-TM或CAFs-Scr（B）共培养时，进行集落形成分析以确定LCCs集落形成能力。以转染miR-Scr的细胞作为对照。将（C-F）A549细胞单独皮下注射或与NFs-Scr、NFs-TM、CAFs-TM或CAFs-Scr联合注射到免疫缺陷小鼠体内。植入6周后取出异种移植物。获得并呈现肿瘤重量（C）。肿瘤的代表性CD31染色切片。用CD31抗体对肿瘤中的血管进行染色，并在显微镜下计数五个区域中阳性染色的血管，每个玻片的微血管数最多，每次实验5片。将结果归一化为A549组，并表示为平均值±SEM；（n=8）（D）。携带指示肿瘤的小鼠肺的代表性苏木精-伊红（HE）染色切片。对肺切片进行扫描，并对转移灶进行评分。转移指数（=转移数除以原发肿瘤重量）（平均值±SEM；n=8）（E）。采用流式细胞术（F）测定肿瘤中CSF-1R+F4/80+的百分比（平均值±SEM；n=8）*p<0.05，**p<0.001，NS显示非统计意义。

**图3。CCL2/VEGFA在CAFs和LCCs共培养系统中起主要作用。**
（A） A549与NFs-Scr、NFs-TM或CAFs-Scr共培养48 h。用Bio-Plex细胞因子阵列测定无细胞培养上清中各种因子的水平。所有细胞因子水平均归一化为NFs-Scr-A549共培养CM中IL-1α的水平。将每个细胞因子的相对水平与特定细胞因子进行比较。日期显示为三倍体的折叠诱导。（B，C）进行细胞迁移试验和集落形成试验，以确定LCCs细胞迁移和集落生成能力，当使用指示的分泌因子处理时*p<0.05，**p<0.001。（D，E）进行细胞迁移试验和集落形成试验，以确定当使用CAFs-LCCs共培养CM并添加抗体时，LCCs细胞迁移和集落生成能力。以NFs-LCCs共培养CM作为对照*p<0.05，**p<0.001。#<0.001表示CAFs-LCC与NFs-LCC共培养。（F） CAFs-shScr与A549-shScr细胞或A549-sh CCL2/VEGFA共培养；或CAFs-shCCL2/VEGFA细胞或NFs-shScr细胞与A549-shScr共培养2天。对培养基进行CCL2或VEGFA酶联免疫吸附试验**p<0.001。

**图4。CCL2/VEGFA和FOXO3a是miR-1、miR-206和miR-31的直接靶点。**
（A） CCL2/VEGFA和FOXO3a 3'-UTR区域中miR-1、miR-206和miR-31推定结合位点的比对显示miR-1，miR-206-CCL2/VEGFA和miR-31-FOXO3a-UTR报告结构的互补碱基配对。（B）将报告构建体与pre-miR-1、pre-miR-206、pre-miR-31或miR-Scr和β-gal质粒共转染到293T细胞中。48小时后，通过荧光素酶与β-半乳糖活性的比值确定相对荧光素素酶活性，并将其归一化为对照组的相对荧光素酶活性。（C） CAF转染单个或两个前miR-1和前miR-206；用单抗miR-1和抗miR-206转染NFs，并与A549共培养48小时。用ELISA试剂盒检测CM中CCL2和VEGFA的水平，一式三份。（D） NFs（上面板）或CAF（下面板）分别转染前miR-31、抗miR-31或对照（前miR-Scr或抗-miR-Scr）48h。用免疫印迹法检测FOXO3a的表达。（E） A549与携带FOXO3a或GFP的慢病毒感染的CAF共同培养作为对照。用ELISA试剂盒检测CM中CCL2和VEGFA的水平，一式三份*p<0.05，**p<0.001。

**图5。通过抗体或miRNAs靶向CCL2/VEGFA可抑制肺部肿瘤生长。**
（A） NFs-Scr、NFs-TM、CAFs-TM或CAFs-Scr与LCC共培养48小时，收集CM。对LCCs-NFs-TM共培养的CM进行抗CCL2/VEGFA治疗或不治疗；对LCCs-CAFs-TM共培养的CM进行CCL2/VEGFA处理或不处理。进行细胞迁移试验以评估LCCs对这些CM的迁移效率。（B）进行集落形成试验以确定LCCs与NFs-Scr、NFs-TM、CAFs-TM或CAFs-Scr共培养时的集落形成能力，如图B所示，添加或不添加抗CCL2/VEGFA或CCL2/VEGFA。（C-F）将A549细胞与CAF共同皮下注射到免疫缺陷小鼠体内。对于中和抗体治疗，在肿瘤植入7天后，通过每周两次腹腔注射（i.p.），以2 mg/kg/剂量给小鼠注射小鼠IgG或抗小鼠CCL2和/或抗VEGF 164，持续6周（C）。肿瘤的代表性CD31染色切片。相对肿瘤微血管密度以平均值±SEM表示；（n=8）（D）。携带指定肿瘤的小鼠肺的代表性HE染色切片。表达（C）中各组小鼠的肺转移指数（平均值±SEM；n=8）（E）。采用流式细胞术（F）测定肿瘤中CSF-1R+F4/80+的百分比（平均值±SEM；n=8）*p<0.05，**p<0.001 vs IgG。（G-J）对于miRNAs注射治疗，使用MaxSuppressor配制miRNA体内从肿瘤细胞植入（G）后第5天开始，每隔5天通过尾静脉注射给药RNALancerII和配方miRNAs。肿瘤的代表性CD31染色切片。相对肿瘤微血管密度以平均值±SEM表示；（n=8）（H）。携带指定肿瘤的小鼠肺的代表性HE染色切片。表达（G）中各组小鼠的肺转移指数（平均值±SEM；n=8）（I）。采用流式细胞术（J）测定肿瘤中CSF-1R+F4/80+的百分比（平均值±SEM；n=8）*p<0.05，**p<0.001 vs miR-Scr。

**图6。miRNAs重编程NFs-CAF转换模型。**
在这个模型中，在癌细胞的影响下，miR-1、miR-206的下调和miR-31表达的上调有助于NFs转化为CAF。重组NFs（NFs-TM）或CAF在通过增加细胞因子（CCL2和VEGFA）的分泌促进共培养癌细胞迁移、集落形成、TAM招募、肿瘤生长和血管生成方面比NFs和重组CAF更有效。

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1. Tomasek JJ、Gabbiani G、Hinz B、Chaponnier C、Brown RA。肌成纤维细胞与结缔组织重塑的机械调节。《自然》杂志评论分子细胞生物学。2002;3(5):349–63. 10.1038/nrm809。-内政部-公共医学
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这项工作得到了国家自然科学基金的部分资助（81202032，81172140，81272532）；江苏省233省临床科技项目（临床研究中心，BL2012008）、江苏省高等学校重点学科建设项目（JX10231801）。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

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[1] Kallui R，Zeisberg M.癌症中的成纤维细胞。《自然》杂志评论癌症。2006;6(5):392–401. 10.1038/nrc1877。-内政部-公共医学

[2] Kallui R，Zeisberg M.癌症中的成纤维细胞。《自然》杂志评论癌症。2006;6(5):392–401. 10.1038/nrc1877。-内政部-公共医学

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[6] Parsonage G、Filer AD、Haworth O、Nash GB、Rainger GE、Salmon M等。由成纤维细胞定义的基质地址代码。免疫学趋势。2005;26（3）:150-6。10.1016/j.it.2004.11.014-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[7] Mueller MM，Fusenig NE。朋友还是敌人——癌症中肿瘤基质的双极效应。《自然》杂志评论《癌症》。2004;4(11):839–49. 10.1038/nrc1477。-内政部-公共医学

[8] Mueller MM，Fusenig NE。朋友还是敌人——癌症中肿瘤基质的双极效应。《自然》杂志评论《癌症》。2004;4(11):839–49. 10.1038/nrc1477。-内政部-公共医学

[9] Orimo A、Gupta PB、Sgroi DC、Arenzana-Seisdedos F、Delaunay T、Naeem R等。浸润性乳腺癌中存在的基质成纤维细胞通过SDF-1/CXCL12分泌增加促进肿瘤生长和血管生成。单元格。2005;121(3):335–48. 2016年10月10日/j.cell.2005.02.034。-内政部-公共医学

[10] Orimo A、Gupta PB、Sgroi DC、Arenzana-Seisdedos F、Delaunay T、Naeem R等。浸润性乳腺癌中存在的基质成纤维细胞通过SDF-1/CXCL12分泌增加促进肿瘤生长和血管生成。单元格。2005;121(3):335–48. 2016年10月10日/j.cell.2005.02.034。-内政部-公共医学

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