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.2016年11月；102（4）：642-671。
doi:10.1111/mi.13484。 Epub 2016年10月7日。

烟曲霉SchASCH9系列激酶调节SakAHOG1型MAP激酶活性及其对毒力至关重要

帕蒂西亚·阿尔夫斯·德·卡斯特罗 1, Thaila Fernanda Dos Reis公司 1, 史蒂芬·K·多兰 2, 阿德里亚娜·奥利维拉·曼菲奥利 1, 尼尔·安德鲁·布朗 三, 加里·琼斯 2, 长多伊尔 2, 迭戈·M·里亚诺·帕肖恩 4, Fábio Márcio鱿鱼 4, 卡米拉·卡尔达纳 4 5, 阿舒托什·辛格 6, 毛里齐奥·德尔·波塔 6, 大辅下原 7, 拉斐尔·席尔瓦·罗查 8, 古斯塔沃·H·戈德曼 1
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烟曲霉SchASCH9系列激酶调节SakAHOG1型MAP激酶活性及其对毒力至关重要

帕蒂西亚·阿尔夫斯·德·卡斯特罗等。 摩尔微生物. 2016年11月.

摘要

作为雷帕霉素靶标的丝氨酸-三氢嘌呤激酶TOR是真核生物营养、能量和应激信号的重要调节因子。Sch9是AGC家族的Ser/Thr激酶（cAMP依赖性PKA、cGMP依赖性蛋白激酶G和磷脂依赖性蛋白酶C家族），是TOR的底物。在此，我们对真菌条件致病菌烟曲霉Sch9同源物（SchA）进行了表征。schA缺失突变体对雷帕霉素、高浓度钙、高渗胁迫敏感，schA参与铁代谢。ΔschA缺失突变体显示烟曲霉Hog1同源物SakA的磷酸化增加。schA缺失突变体分别增加和减少了海藻糖和甘油的积累，表明schA在渗透胁迫期间对甘油和海藻糖的积累起着不同的作用。schA由渗透胁迫转录调节，这种反应依赖于SakA和MpkC。ΔschAΔsakA和ΔschAΔmpkC双突变体对渗透胁迫比相应的亲本菌株更敏感。转录组学和蛋白质组学确定了SchA暴露于高渗应激后的直接和间接靶点。最后，ΔschA在低剂量小鼠感染模型中是无毒的。我们的结果表明烟曲霉TOR、SakA和SchA途径之间存在复杂的相互作用网络。

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数字

图1
图1
这个烟曲霉ΔschA公司突变体对渗透胁迫和钙浓度增加更敏感。A和B烟曲霉野生型，ΔschA公司和ΔschA公司时间：schA公司+在MM上，MM+CaCl2500 mM或mM+MnCl21 mM。数据表示为径向生长山梨醇/径向生长对照（mM）。C.将菌株接种在山梨醇或氯化钠浓度增加的液体MM中，并在37°C下搅拌培养48 h。数据表示为干重山梨醇/干重对照（g）。径向直径和干重数据表示为三个独立生物重复的平均±标准偏差（*和***表示第页分别<0.01和0.001t吨-与野生型菌株相比时的ests）。D和E.对Rps6的总蛋白水平和磷酸化状态进行Western blot分析。野生型和ΔschA公司菌株在37°C下生长16小时，并暴露于或不暴露于雷帕霉素或渗透胁迫。通过Ponceau红染色对蛋白质进行标准化。使用Image J软件通过划分SakA-P/SakA比值的强度来量化信号强度，并表示为对照组（0分钟）的倍数增加。
图2
图2
烟曲霉ΔschA对雷帕霉素更敏感。将菌株接种在YG培养基+Alamar Blue中，增加雷帕霉素浓度，并在37°C下培养48 h。这个实验重复了三次，这里显示的实验是一个具有代表性的实验。
图3
图3
这个schA公司空突变增加了SakA磷酸化。A.渗透胁迫下SakA磷酸化的免疫印迹分析。野生型和schA公司空白突变体在37°C下生长18小时。然后，不添加山梨醇（1M终浓度）（对照），并添加0（对照）、10、60、120和240分钟。在指定时间收获菌丝体，提取总蛋白。用抗磷酸p38检测SakA的磷酸化，用抗Hog1p检测总SakA蛋白。考马斯亮蓝（CBB）染色凝胶显示为负载控制。使用Image J软件通过划分SakA-P/SakA比值的强度来量化信号强度，并表示为对照组（0分钟）的倍数增加。B.ΔschA公司突变体表现出较高的渗透压依赖性基因表达。野生型和ΔschA公司突变体在37°C下生长18小时。然后，添加山梨醇（1 M最终浓度）0（对照）、1、2和4 h。在指定的时间收获菌丝体，并提取总RNA。绝对定量类别A,dprA（千帕）、和dprB（分贝）和行动A（Afu6g04740，编码肌动蛋白）由标准曲线（即C吨-数值与DNA拷贝数的对数相对应）。结果是四个生物复制品（*，第页<0.001，与野生型治疗的比较）。C和D.野生型中甘油和海藻糖的积累，ΔschA公司和ΔschA公司时间：schA公司+渗透胁迫下的应变。菌株在37°C下培养18小时。然后，添加山梨醇（1 M最终浓度）0（对照）、1、2和4 h。分别根据裂解物的体积或干重对甘油和海藻糖进行量化和归一化。结果是三个生物重复（*，第页<0.001，与野生型治疗的比较）。
图4
图4
这个schA公司渗透胁迫下的表达依赖于SakA。野生型Δ萨克，Δ平均功率C和Δ英里/平方公里Δ萨卡突变体在37℃下培养18小时。然后，添加山梨醇（1 M最终浓度）0（对照）、10、30、60和120分钟。在指定的时间收获菌丝体，并提取总RNA。绝对定量schA公司和管C由标准曲线（即C吨–数值与DNA拷贝数的对数相对应）。结果是四个生物重复（*，第页<0.001，与野生型治疗的比较）。
图5
图5
这个烟曲霉ΔschA公司基因与Δ相互作用萨克和安培C渗透胁迫。野生型（CEA17 pyrG+或AfS35），ΔschA公司，Δ萨卡，ΔschA公司Δ萨克，Δ英里/平方公里，ΔschA公司Δ英里/平方公里在37°C条件下，在山梨醇浓度增加的MM中培养72小时。数据表示为径向生长山梨醇/径向生长控制（mm）。径向直径数据表示为三个独立生物重复的平均±标准偏差（*表示第页<0.001，依据t吨-与野生型菌株相比进行测试）。
图6
图6
这个烟曲霉Δ英里/平方公里和Δ英里/平方公里Δ萨克突变体对雷帕霉素更敏感。将菌株接种在YG培养基+Alamar Blue中，增加雷帕霉素浓度，并在37°C下培养48 h。这个实验重复了三次，这里显示的实验是一个具有代表性的实验。
图7
图7
在rapamcyin存在下，当渗透胁迫时，MpkC:：GFP迁移到细胞核。A.SakA:：GFP和MpkC:：GFP菌株在MM中30°C下生长16 h，并在30°C存在1.0 M山梨醇、30°C有雷帕霉素B 2µg/ml、30°C有雷帕霉素C 2µg/ml和1.0 M山梨醇的情况下培养30 min。棒材，5µm。
图8
图8
ΔschA公司突变体降低了鞘脂的生成。A.野生型ΔschA公司和ΔschA公司时间：瑞士法郎+菌株接种在MM培养基+Alamar Blue中，并增加植物鞘氨醇（PHS）的浓度，在37°C下培养48小时。B.鞘脂生物合成途径示意图（改编自Swinnen等.，2014b）以红色显示不同中介机构或产品的减少。HexCer=己糖神经酰胺；OH-Cer=羟基神经酰胺；dhCer=二氢神经酰胺类；Sph=鞘氨醇；Sph-1-P=1-磷酸鞘氨醇；Cer=神经酰胺；αOHPhytoCer=具有不同长度酰基链的植物神经酰胺；PhytoCer=植物神经酰胺种类；IPC=肌醇磷酰神经酰胺。
图9
图9
RNA-seq和蛋白质组学数据的聚类分析。A.对RNAseq数据的分析表明，根据有或无渗透胁迫的基因行为，存在八种不同的表达谱（C1-C8）。B.蛋白质组学数据的聚类分析，无渗透胁迫或暴露2或4小时，揭示存在10个蛋白质表达谱（C1-C10）。所有分析均使用MeV软件中的层次聚类进行(http://www.tm4.org/mev.html).
图10
图10
烟曲霉SchA参与铁代谢。A.野生型和ΔschA公司突变菌株在MM，MM+200µM FeS0中生长48小时4或AMM+300µM铁锌（*，第页<0.01，与Δ相比为野生型schA公司). B.蛋白质印迹分析烟曲霉总的和磷酸化的Rps6A。野生型和ΔschA公司菌株在37°C下生长20小时，暴露或不暴露铁过量或饥饿（60或120分钟），并提取总蛋白。通过Ponceau红染色对蛋白质进行标准化。使用Image J软件通过划分SakA-P/SakA比值的强度来量化信号强度，并表示为对照组（0分钟）的倍数增加。C.RTqPCR烟曲霉基因。菌株在37°C下生长20 h，并在铁过量或饥饿条件下转移1 h和2 h。结果表示为对照组的倍增（在没有铁过量或饥荒的情况下），结果用管C表达式。D.RTqPCR西达烟曲霉、和新加坡能源局基因。菌株在37°C下生长20 h，并在铁过量或饥饿条件下转移1 h和2 h。结果表示为对照组的倍增（在没有铁过量或饥荒的情况下），结果用管C表达式。E和F.野生型和Δ的气相色谱研究的主成分分析（PCA）schA公司缺铁（左面板）和过剩（右面板）期间的应变。
图11
图11
A类烟曲霉schA有助于中性粒细胞减少小鼠的毒性。A.肺曲霉病中性粒细胞减少小鼠模型中野生型和突变株的比较分析。每组10只小鼠经鼻感染20µl分生孢子悬浮液，剂量为105B.在感染后72 h对感染小鼠的肺部进行组织学分析（C）感染后72小时通过基于18S rRNA基因的qPCR测定真菌负荷烟曲霉和小鼠GAPDH基因的内含子区域。
图12
图12
一种可能的相互作用模型烟曲霉营养感应和渗透胁迫期间的SchA、钙调神经磷酸酶/CrzA和SakA/MpkC。烟曲霉TOR在营养感应或渗透胁迫期间磷酸化SchA和Rps6 SchA。SchA还磷酸化Rps6和其他靶点，并激活未知转录因子（UTF）。UTF将通过重要蛋白转运至细胞核并与上游调控元件（URE）结合，激活与核糖体生物生成、铁同化、鸟氨酸、氨基酸生物合成、渗透应激反应和鞘磷脂生物合成相关的靶点。在渗透胁迫下+2)在细胞质中释放，激活钙调神经磷酸酶复合物（CalA和CalB分别是催化和调节亚单位），将转录因子CrzA去磷酸化。CrzA将通过导入蛋白转运至细胞核并与URE结合，激活编码HOG/SakA通路MAP激酶和双组分系统（TCS）蛋白质的基因。增加（Ca+2)，CrzA绑定到schA公司URE转录激活该基因。尚不清楚TOR和钙调神经磷酸酶/CrzA之间是否存在任何相互作用。MAPK-SakA和MpkC受TOR控制，在营养感应或渗透胁迫时会转移到细胞核，并与染色质相互作用。很可能MpkC调节SakA并磷酸化几个UTF以激活它们作为转录因子。
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