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.2016年8月16日；11（8）：e0161289。
doi:10.1371/journal.pone.0161289。 2016年eCollection。

睾丸特异性Bb8在精子线粒体发育中至关重要

维克托·维德利克 1, 芭芭拉·劳林耶茨 1, Attila L Kovács酒店 2, Gábor Juhász 2, 丽塔·辛卡 1
附属公司

睾丸特异性Bb8在精子线粒体发育中至关重要

维克托·维德利克等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

线粒体是果蝇发育中精子细胞的重要细胞器，减数分裂后，精子细胞在大小和形状上发生巨大变化，线粒体定位在细胞质中，迁移到细胞核附近，聚集、融合并形成Nebenkern。在精子细胞伸长过程中，两种类似的Nebenkern线粒体衍生物开始平行于轴丝伸长。其中一个细长的线粒体衍生物开始失去体积，成为次要的线粒体衍生物，而另一个聚积副晶体，成为主要的线粒体衍生物。需要确定在主要线粒体衍生物中负责囊肿伸长和副结晶形成的蛋白质和细胞内环境。在这项工作中，我们研究了睾丸特异性大气泡8（bb8）基因在精子发生过程中的功能。我们发现，bb8基因中的Minos元件插入，即预测的谷氨酸脱氢酶，会导致隐性雄性不育。我们证明了精子细胞中bb8 mRNA的富集以及精子发生过程中bb8蛋白的线粒体定位。我们报告称，在伸长精子细胞的纯合突变睾丸中发育有巨线粒体。细长精子细胞横截面的超微结构分析显示，线粒体增大，主要和次要线粒体衍生物中均产生副晶体。我们的结果表明，在精子细胞伸长过程中，Bb8蛋白和可能的谷氨酸代谢在线粒体衍生物的正常发育和鉴定中起着关键作用。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。Bb8是一种睾丸特异性谷氨酸脱氢酶。
（A） 基因组组织英国广播公司8轨迹和惯性矩{ET1}CG4434MB10362型基因第一外显子的转座子插入英国广播公司8。粗灰色条表示UTR序列，粗蓝色条表示编码序列，细黑色条表示内含子和非编码区域。示意图显示了基因组拯救构造(英国广播公司8克)（棕色条）和用于构建GFP报告子的基因组区域（深绿色条）(英国广播公司8100aa奈拉). 箭头表示用于克隆转基因（黑色）和Q-RT-PCR（蓝色）的引物对。（B-C）Bb8在果蝇属种（B）和高等生物（C）。采用最大似然（B，C）方法构建bootstrap共识蛋白系统发育图。引导值显示在相关节点旁边。（D） 的表达式英国广播公司8mRNA仅限于睾丸，并且在第8页毫秒突变睾丸样本。相对第8页通过Q-RT-PCR从野生型（WT）和英国广播公司8毫秒突变体，使用英国广播公司8和第49页特异性引物。测量一式三份，第49页用作参考。
图2
图2。英国广播公司8睾丸表达。
（A）现场反义杂交英国广播公司8探针显示了英国广播公司8从8细胞期（箭头）和RNA存在于WT睾丸减数分裂囊肿（箭头）。比例尺：200μm。（B） 相对mRNA表达CG3927号,太阳和英国广播公司8用Q-RT-PCR从解剖的WT睾丸尖端和减数分裂后区域测量。mRNA表达标准化为CG10252号。测量一式三份。（C，D）基因组报告子结构的表达，第8页N100氨基酸-绿色荧光粉用Mitotracker染色显示精母细胞（箭头）、伸长精子细胞（C，C'，C“）（箭头）和圆形精子细胞（D，D'，D“）中的线粒体定位。细胞核（箭头）通过相位对比显微镜（D“，D”）进行可视化。比例尺：10μm。
图3
图3。晚期精子发生失败导致男性不育英国广播公司8毫秒.
（A） 在WT睾丸中，不同阶段的囊肿和带有成熟精子的精囊（箭头所示）可通过相差显微镜进行区分。（B） 在英国广播公司8毫秒睾丸突变体，精子发生早期正常，有细长的囊肿，但精囊（箭头）是空的，没有成熟精子。（C，D）在英国广播公司8毫秒突变睾丸。（C） WT睾丸中的延伸囊肿含有富含肌动蛋白的个体化复合物，并用Texas Red-X指骨样蛋白染色（红色）标记。用多糖基化轴突微管蛋白特异性AXO 49染色（绿色）标记伸长囊肿和卷曲精子细胞（箭头）。（D） 在英国广播公司8毫秒突变睾丸没有个体化复合体，每个睾丸的聚糖化囊肿较少，也没有螺旋精子细胞（箭头所示）。细胞核DAPI染色。比例尺：200μm。（E） 在WT（蓝色）睾丸中，每个睾丸平均有7.98个AXO 49阳性囊肿。在英国广播公司8米（绿色）突变体AXO 49阳性囊肿的数量减少，平均每个睾丸4.57个。（F） AXO 49阳性囊肿的平均长度显示在WT（n=36）和英国广播公司8毫秒突变体（n=49）。误差线表示平均值±标准误差。统计显著性通过Student t检验确定（p<0.001）。
图4
图4。精子细胞伸长前线粒体发育正常。
（A-B）初级精母细胞有正常线粒体，WT（A）和第8页毫秒（B） 突变体。（C-F'）年Nebenkern的发展英国广播公司8毫秒在洋葱减数分裂后阶段精子细胞（E'，F'）中，突变（D，F）是正常的，与WT（C，E）相似。比例尺：5μm。在WT（G）中，细长精子细胞的（G-H）线粒体被DJ-GFP修饰，但在英国广播公司8毫秒突变体（H）。细胞核DAPI染色。比例尺：200μm。
图5
图5。测试英国广播公司8毫秒突变体在减数分裂后伸长的精子细胞中显示缺陷。
（A-B）来自WT（A）和英国广播公司8毫秒（B） 睾丸都有细长的囊肿，但通过相差显微镜观察，突变体（箭头）中有大的球形囊泡。比例尺：100μm。用ATP5α抗体染色的细长精子细胞（C，D）线粒体在WT（C）和英国广播公司8毫秒（D） 突变体。箭头表示囊肿中大囊泡的ATP5α阳性染色。比例尺：50μm。（E，F）JC-1染色阳性的大囊泡（箭头）在WT（E）中不存在，但在英国广播公司8毫秒细长囊肿（F）。比例尺：25μm。
图6
图6。在第8页毫秒突变体。
（A-F）WT（A，C）和英国广播公司8毫秒苍蝇（B、D、E、F）。体细胞线粒体用红色箭头（A，B）表示。在WT个体化前囊肿（A，C）中，每个精子细胞都有两个线粒体衍生物，主要衍生物为副结晶（黄色箭头）和一个轴丝（C）（红线）。英国广播公司8毫秒前个体化精子细胞在囊肿中失去了同步性，线粒体衍生物中的副晶体经常断裂（B，F）（黄色箭头）。有许多肿胀的线粒体衍生物英国广播公司8毫秒囊肿（B、E、F）（黄色箭头和黄色线）。两种线粒体衍生物都开始在英国广播公司8毫秒囊肿（D-F）（黄色箭头）。比例尺：2μm（A、B、F）0.5μm（C-E）。（G） 描述WT和WT线粒体表型的示意图英国广播公司8毫秒伸长精子细胞。
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赠款和资金

这项工作得到了欧洲分子生物学组织（EMBO）的资助（安装资助（编号1825）(网址：http://www.embo.org)RS和匈牙利科学研究基金（OTKA:NF101001）(http://nkfih.gov.hu/)RS.RS也感谢匈牙利科学院的Bolyai奖学金的资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。