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.2016年8月16日5:e16695。
doi:10.7554/eLife.16695。

隐色素2突变导致人类进入高级睡眠期

阿里莎·平野 1, 石广森 1, 克里斯托弗·琼斯 2, 安娜·利普岑 三 4, Len A Pennacchio先生 三 4, 应旭 5, 威廉·C·圣器 1, 汤马士·麦克马洪 1, 玛雅山崎 1, 路易斯·普塔切克 1 6, 英辉福 1
附属公司

隐色素2突变导致人类进入高级睡眠期

阿里莎·平野等。 埃利夫. .

摘要

家族性高级睡眠期（FASP）是一种可遗传的人类睡眠表型，其特征是睡眠和醒来时间很早。我们在人类隐色素2（CRY2）基因中发现了一个错义突变，该突变与FASP在一个家族中共同分离。突变导致260位的丙氨酸残基被苏氨酸（A260T）取代。在小鼠中，CRY2突变导致昼夜节律缩短，相移至早晚光脉冲减少，这与明暗循环中的相高级行为节律有关。A260T突变位于CRY2的黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）结合域的磷酸环。突变改变了CRY2的构象，增加了其对FBXL3（一种E3泛素连接酶）的可及性和亲和力，从而促进其降解。这些结果表明，FBXL3控制的CRY2稳定性在调节人类睡眠-觉醒行为中起着关键作用。

关键词：FBXL3；家族性高级睡眠期；昼夜节律钟；昼夜节律；隐花色素2；人；人类生物学；药物；小鼠；神经科学。

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利益冲突声明

LJP：审阅编辑器，电子生活.

其他作者声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1。
图1..ACRY2（巡航2）FASP家族50035的突变。
(A类)家族谱系（家族50035）分离CRY2（巡航2）突变（A260T）。圆圈和正方形分别代表女性和男性。一个星号标记先证者。从G到A的错义突变导致260位的氨基酸从丙氨酸转化为苏氨酸。(B类)突变位点周围的氨基酸排列。A260T突变位于CRY2中FAD结合域的N末端。这种残留物在脊椎动物物种中高度保守。CC表示线圈序列。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.16695.003
图2。
图2..hCRY2-A260T型小鼠的睡眠行为处于光-暗循环的高级阶段，而在持续黑暗中的昼夜节律缩短。
(A类)LD中的红外摄像机跟踪鼠标运动。每隔10分钟绘制一次制动时间与每日总制动时间之比（上面板）和步行距离与每日总距离之比（下面板）。数据显示为SEM平均值（n=8小时）CRY2-WT（重量）和hCRY2-A260T型). (B类)通过对ZT0至13的数据拟合二次函数来测量静止峰值时间。h曲线拟合的典型示例CRY2-WT（重量）和hCRY2-A260T型如图所示。数据显示为SEM平均值（n=8，hCRY2-WT（重量）和hCRY2-A260T，*学生的p<0.05t吨-测试）。(C类)运动活动的开始和抵消。数据显示为SEM平均值（n=8，hCRY2-WT（重量）和hCRY2-A260T型). (D类)车轮行驶活动的示意图hCRY2-WT（重量），小时CRY2-A260T，和同窝转基因阴性小鼠。蓝色阴影表示灯亮的时间段。使用ClockLab分析软件将红线拟合到活动开始时间。(E类)响应ZT14处30分钟曝光的相移，由中的红色箭头指示(D类). *通过Tukey检验，p＜0.05（n＝7，hCRY2-WT，n=11小时CRY2-A260T，n=10（WT）。(F类)BAC转基因小鼠和转基因阴性对照小鼠的周期测量分布。周期由DD中第7天到第19天的活动开始线性拟合和齐方周期图确定。*p<0.05（n=15小时CRY2-WT（重量），n=14小时CRY2-A260T型对于WT，n=7）内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.16695.005
图2——图补充1。
图2——图补充1……h的运动活性CRY2（巡航2）BAC-Tg小鼠。
(A类)ZT18时CRY2在总肝裂解物中的表达。CRY2蛋白由人CRY2抗体（Santa Cruz）和小鼠CRY2抗原检测（Hirano等人，2013）。使用小鼠和人的常见序列通过实时PCR测定拷贝数哭泣2基因。(B类)通过视频记录测量的运动活动的代表性轮廓。图中的箭头表示活动开始（黑色）和偏移（红色）。图2C中平均并绘制了各基因型所有动物的发病时间和抵消时间。(C类)转基因小鼠的运动活性和静息行为哭泣2淘汰赛背景。LD中的红外摄像机跟踪鼠标运动。每隔10分钟绘制一次制动时间与每日总制动时间之比（上面板）和步行距离与每日总距离之比（下面板）。数据显示为SEM平均值（n=6小时）CRY2-WT/CRY2KO，n=6小时CRY2-A260T/密码2KO）。显示了LD 12:12的活动偏移和开始的平均值（n=6小时CRY2-WT/CRY2KO，n=6小时CRY2-A260T/密码2KO）。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.16695.006
图2——图补充2。
图2-图补充2..h的车轮运行活动CRY2（巡航2）BAC-Tg小鼠。
(A类)LD 12:12转基因小鼠的活性谱。每20分钟绘制一次车轮运行计数与每日总计数的比率（n=18表示hCRY2-WT（重量），n=14小时CRY2-A260T型). 右图显示了LD 12:12中的活动偏移平均值*经Tukey检验，p<0.05（n=19小时CRY2-WT（重量），n=19小时CRY2-A260T型对于WT，n=7）。(B类)转基因小鼠的行为图和活动曲线哭泣2LD 12:12淘汰赛背景。每5分钟绘制一次车轮运行计数与每日总计数的比率（n=5表示hCRY2-WT（重量），n=5小时CRY2-A260T型). 右图显示了LD 12:12中的活动偏移平均值*经Tukey检验，p<0.05（n=5小时CRY2-WT（重量）/米哭泣2KO，n=5小时CRY2-A260T型/米哭泣2KO和n=6（m）哭泣2KO）。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.16695.007
图2——补充图3。
图2—图补充3……h的光相移CRY2（巡航2）ZT22的BAC Tg小鼠。
(A类)ZT22处30分钟光照下的相移。小鼠在ZT22处暴露30分钟光脉冲（用红色箭头表示），并在光脉冲后释放到DD中。蓝色阴影表示灯亮的时间段。使用ClockLab分析软件将红线拟合到活动开始时间。相移通过对活动开始的线性填充来确定（n=6小时CRY2-WT（重量），n=7小时CRY2-A260T型和WT）。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.16695.008
图2-图补充4。
图2-图补充4..h的车轮运行活动CRY2冷冻2以m KO为背景的BAC-Tg小鼠和另一种BAC-Tg-小鼠系。
(A类)转基因小鼠的昼夜节律哭泣2淘汰赛背景。周期由DD中从第7天到第14天的齐方周期图确定。*p<0.05由Welch检验确定（n=6小时CRY2-WT（重量）/米哭泣2KO和n=5（h）CRY2-A260T型/米哭泣2KO）。(B类)h的昼夜周期和相移CRY2-A260T型老鼠线2。h车轮运行活动的代表性活动图CRY2-A260T型2号线和室友控制(重量)如图所示。蓝色阴影表示灯亮的时间段。使用ClockLab分析软件将红线拟合到活动开始时间。此处显示的相移是在ZT14下曝光30分钟（左图，n=7，持续hCRY2-A260T型第2行，n=3重量). 周期由DD中第7天至第19天活动开始的线性拟合确定。*p<0.05由Student’st吨-测试（右侧面板，n=7小时CRY2-A260T型第2行，n=3重量).内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.16695.009
图3。
图3.来自h的组织培养中的生物发光节律CRY2-A260T型小鼠和CRY2-A260T型稳定的细胞系。
(A类)肝和肺中PER2:：LUC生物发光的代表性节律。数据被减去24 生物发光的hr平均值。(B类)肝和肺组织生物发光节律的周期测量。数据显示为平均值±SEM（肝脏和h的n=4CRY2-WT（重量）肺，n=3小时CRY2-A260T型肺，*p<0.05（学生）t吨-测试）。(C类)小鼠肝和肺组织PER2:：LUC生物发光节律的峰谷时间。数据显示为平均值±SEM（肝脏n=4）。数据显示为平均值±SD（肺n=2至4，*p<0.05t吨-测试）。(D类)h MEF中PER2:：LUC生物发光的代表性节律CRY2（巡航2）转基因小鼠。数据被减去24 生物发光的hr平均值。生物发光节律的周期长度显示为平均值±SEM（根据Tukey的测试，n=4，*p<0.05）。(E类)m生物发光节律的代表性示例Bmal1-luc在转基因小鼠的MEF中哭泣2淘汰赛背景。用m转染细胞Bmal1型-luc矢量24 录音前1小时。数据被减去24 生物发光的hr平均值。稳定细胞系中生物发光节律的周期长度显示为平均值±SEM（通过Games-Howell测试，n=4，*p<0.05）。(F类)生物发光节律的典型示例Bmal1-luc在NIH3T3细胞中稳定表达FLAG-CRY2-WT或FLAG-CRY2-A260T。数据被减去24 生物发光的hr平均值。稳定细胞系中生物发光节律的周期长度显示为平均值±SEM（n=3，*p<0.05，由Student’st吨-测试）。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.16695.010
图4。
图4 CRY2-A260T不太稳定，尤其是在核中。
(A类)小鼠驱动的萤光素酶活性每个1HEK293电池中的电子盒。将2、5、10和20 ng hCRY2表达载体（WT或A260T）转染到24孔板中培养的细胞中。荧光素酶活性归一化为Renilla荧光素酶活性。数据显示为SEM的平均值（n=4，*p<0.05，由Student’st吨-测试）。(B类)HEK293细胞核和细胞溶质部分CRY2-WT和CRY2-A260T的蛋白质水平。数据显示为SEM平均值（n=3，*p<0.05t吨-测试）。(C类)CRY2蛋白在HEK293细胞中的降解试验。转染48小时后，用100μg/ml CHX处理细胞，并将其分为细胞核和细胞溶质部分。起点CRY2蛋白水平（t=0 hr）标准化为1。数据显示为SEM的平均值（n=3*，学生的p<0.05t吨-测试）。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.16695.011
图4-图补充1。
图4-图补充1.A260突变对蛋白质稳定性、阻遏物活性的影响。
(A类)转染后24小时，将培养基更换为含有100µg/ml CHX的记录介质，并连续记录CRY2-LUC（WT、A260T或A260D）的生物发光。将归一化为起点的生物发光拟合成指数曲线，以确定CRY2-LUC的半衰期（右侧面板）。数据显示为平均值±SEM（根据Tukey的测试，n=4，*p<0.05）。左图显示了CRY2-LUC的代表性生物发光衰变。(B类)小鼠驱动的萤光素酶活性每个1电子盒。10或25纳克CRY2（巡航2）将构建物转染至24孔板培养的HEK293细胞。荧光素酶活性归一化为Renilla荧光素酶活性。数据显示为平均值±SEM（根据Tukey的测试，n=3，*p<0.05）。(C类)CRY1蛋白在HEK293细胞中的降解试验。转染60小时后，用100μg/ml CHX处理细胞，并将其分为细胞核和细胞溶质部分。起始点的CRY1蛋白质水平（t=0 hr）标准化为1。数据显示为SEM的平均值（n=3*，学生的p<0.05t吨-测试）。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.16695.012
图5。
图5.CRY2-A260T与FBXL3结合更强烈，导致突变CRY2降解更快。
(A类)人类的影响FBXL3型敲除HEK293细胞中CRY2蛋白的稳定性。转染48小时后，将培养基更换为含有100μg/ml CHX的记录介质，并连续记录CRY2-LUC的生物发光。将生物发光标准化为时间0时的值，拟合成指数曲线，以确定CRY2-LUC的半衰期。数据显示为SEM平均值（n=4，*Welch的p<0.05t吨-测试）。(B类)FAD对CRY2蛋白水平的影响。转染后42小时，用100μM FAD处理HEK293细胞6 hr.数据显示为SEM平均值（n=3，*p<0.05，由Student’st吨-测试）。(C类)FAD和FBXL3竞争分析。使用FLAG抗体纯化HEK293细胞中表达的CRY2-FBXL3复合物。将FAD添加到CRY2-FBXL3复合物中，并在4°C下培养2 体外培养小时。(D类)KL001处理的细胞中CRY2蛋白的稳定性。转染后24小时，将培养基更换为含有100μg/ml CHX和KL001的记录介质。如上所述进行生物发光记录和半衰期计算*学生的p<0.05t吨-测试（n=3）。(E类)MG132作用6小时后HEK293细胞中CRY2与FBXL3的相互作用 收割前1小时。(F类)CRY2的泛素化。用MG132处理表达FLAG-CRY2的HEK293细胞6次 收割前小时。然后纯化FLAG-CRY2并用抗泛素抗体进行印迹。定量数据显示为SEM平均值（n=3，*p<0.05，由Student’s得出t吨-测试）。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.16695.013
图5——图补充1。
图5——图补充1。A260T CRY2的结构建模。
(A类)KL001处理的细胞中CRY2蛋白的稳定性。转染后24小时，将培养基改为含有100μg/ml CHX和KL001的记录培养基，浓度为指示浓度*学生的p<0.05t吨-测试（n=3）。(B类)绑定到FAD（PDB代码4I6G）（橙色）或FBXL3（4I6J）（红色）的鼠标CRY2的结构。绿色表示FBXL3。短虚线表示A259的侧链（人类CRY2的A260）。与FAD-bound CRY2相比，与FBXL3结合的CRY2构象更开放。(C类)绑定到FBXL3的小鼠CRY2-WT（顶部）或小鼠CRY2-A259T（对应于人类CRY2-A260T，底部）的结构。丙氨酸到苏氨酸的突变增加了分子密度，并可能改变CRY2的构象，从FAD结合形式变为FBXL3结合形式，其中围绕A259的主链在这张图片中移向左侧。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.16695.014
图6。
图6 CRY2-A260T表达在h内下调CRY2-A260T型老鼠。
(A类)同步MEF中CRY2蛋白水平。用100 nM Dex处理细胞2 hr同步细胞节律。培养基发生改变，MEF培养24或36 收割前小时。CRY2（小鼠CRY2和人类CRY2）的定量带强度显示为平均值±SEM（n=3，*p<0.05）t吨-测试）。(B类)同步MEF中时钟基因的mRNA水平。MEF的细胞节律与100 nM Dex同步2 实时PCR定量hr.mRNA水平。数据显示为平均值±SEM（n=3，*p<0.05）t吨-测试）。(C类)小鼠肝脏中PER1、PER2、CRY1和CRY2的时间表达谱。每4只老鼠被处死一次 在DD的第二天出现hr。星号标记非特异性条带。(D类)蛋白质水平的定量(C类). 数据显示为平均值±SEM（n=3）。(E类)小鼠肝脏中指示时钟基因的mRNA水平。每4只老鼠被处死一次 第二天，用基因特异性引物实时PCR定量显示基因的mRNA水平。数据显示为平均值±SEM（n=3）。(F类)CRY2蛋白调节模型。在野生型中，与CRY2结合的FAD通过与FBXL3竞争来稳定。单位：小时CRY2-A260T型具有CRY2突变的转基因小鼠或FASP人类受试者，FAD不能保护CRY2免受FBXL3介导的降解。CRY2失稳导致睡眠时间缩短，导致睡眠期提前。在Fbxl3型基因敲除小鼠或突变小鼠(加班和下班后)（Godinho等人，2007；Siepka等人，2007），CRY2在细胞核中稳定，从而延长了昼夜节律周期。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.16695.015
图6——图补充1。
图6：补充1……MEF和h的肝脏中时钟基因的mRNA水平CRY2（巡航2）BAC-Tg小鼠。
(A类)同步MEF中指示基因的mRNA水平。MEF的细胞节律与100 nM Dex同步2 实时PCR定量hr.mRNA水平。数据显示为平均值±SEM（n=3，*p<0.05）t吨-测试）。(B类)小鼠肝脏中指示时钟基因的表达模式。每4只老鼠被处死一次 第二天，用基因特异性引物实时PCR定量显示基因的mRNA水平。数据显示为平均值±SEM（n=3）。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.16695.016
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