跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2016年10月7日；291(41):21616-21629.
doi:10.1074/jbc。M116.733410。 Epub 2016年8月15日。

BNIP3蛋白抑制PINK1激酶蛋白裂解促进有丝分裂

张彤梅（Tongmei Zhang） 1, 梁雪 2, 李丽 1, 成元汤 1, 正清丸 1, 王若西 1, 杰琼滩 1, 亚坦 1, 海龙汉 1, 田润一 1, 蒂莫西·比利尔 1 三, W Andy Tao 2, 张灼华教授 4 5
附属公司

BNIP3蛋白抑制PINK1激酶蛋白裂解促进有丝分裂

张彤梅（Tongmei Zhang）等。 生物化学杂志. .

摘要

PINK1（PTEN诱导的假定激酶1）突变导致早发家族性帕金森病（PD）。PINK1积聚在受损线粒体的外膜上，随后补充parkin以促进有丝分裂。在这里，我们证明了BCL2/腺病毒E1B19kDa相互作用蛋白3（BNIP3），一种仅含线粒体BH3的蛋白，与PINK1相互作用，促进全长PINK1在线粒体外膜上的积累，这促进了parkin募集和PINK1/parkin介导的线粒体自噬。哺乳动物细胞中BNIP3的失活促进PINK1蛋白水解过程并抑制PINK1/parkin介导的有丝分裂。低氧诱导的BNIP3表达导致全长PINK1的表达增加和有丝分裂。果蝇BNIP3的表达一贯抑制PINK1失活引起的肌肉变性和线粒体异常。总之，这些结果表明，BNIP3在生理条件下调节PINK1线粒体外膜定位、蛋白水解过程以及PINK1/parkin介导的有丝分裂中起着重要作用。BNIP3的功能上调可能是一种抑制PD进展的新治疗策略。

关键词：帕金森病；缺氧；线粒体；停车场；泛素。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
BNIP3-PINK1相互作用抑制PINK1的蛋白水解裂解。 A类BNIP3和PINK1的联合免疫沉淀。表达PINK1-FLAG或/和Myc-BNIP3的HEK293细胞被免疫沉淀(IP（IP）)使用抗FLAG抗体，然后使用抗BNIP3或抗FLAG标签进行免疫印迹。输入控件显示在左侧面板。B类，全长PINK1与BNIP3相互作用。用抗Myc标签免疫沉淀表达PINK1-FLAG或/和Myc-BNIP3或parkin-Myc的HEK293细胞，并用抗PINK1或抗Myc标记免疫印迹（检测BINP3或parkin）。parkin-PINK1相互作用是免疫共沉淀的对照。输入控件显示在左侧面板。C类内源性BNIP3和PINK1的联合免疫沉淀。用对照IgG或抗BNIP3免疫沉淀HEK293细胞，然后用抗PINK1免疫印迹。输入控件显示在左侧面板。天，PINK1 MTS缺失会削弱PINK1-BNIP3的交互作用。将带有空质粒（−）、FLAG标记的PINK1（WT）或MTS缺失的PINK1（ΔN）的Myc-BNIP3联合转染HEK293细胞，然后进行CCCP处理。用抗FLAG标签免疫沉淀裂解液，然后用抗BNIP3或抗FLAG免疫印迹。输入控件显示在左侧面板。E类，BNIP3ΔTM削弱其与PINK1的相互作用。用空质粒（−）、Myc-tagged BNIP3（WT）或Myc-tag BNIP3ΔTM联合转染HEK293细胞PINK1-FLAG，然后进行CCCP处理。用抗FLAG免疫沉淀裂解液，然后用BNIP3或FLAG标记免疫印迹。输入控件显示在左侧面板。F类，BNIP3调节的PINK1变异体的定量。采用单因素方差分析、Dunnett检验或Tukey检验对64和55-kDa PINK1变异体的相对水平以及有/无CCCP治疗的64-kDa/55-kDa PINK1比值进行量化、计算和分析。误差线S.E.公司。；n个= 4. *,第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001.G公司MG132处理的BNIP3影响PINK1解理。用MG132处理表达PINK1-FLAG或/和Myc-BNIP3的HEK293细胞。用PINK1抗体对裂解产物进行免疫印迹(顶部面板)或抗Myc(中间面板). β-微管蛋白(底部面板)是装载控制。H（H）和我BNIP3增加了全长PINK1的稳定性。用CHX处理表达PINK1-FLAG或/和Myc-BNIP3的HEK293细胞，然后用PINK1抗体免疫印迹(顶部面板)抗Myc(中间面板). β-肌动蛋白(底部面板)是装载控制(H（H）). 显示了受BNIP3影响的PINK1变异体的量化。误差线S.E.公司。；n个= 3 (我).
图2。
图2。
线粒体定位对于BNIP3抑制PINK1裂解至关重要。 A类，BNIP3变体的图示。BNIP3型ΔTM公司C末端跨膜结构域缺失；BNIP3 H173A型，二聚化突变体；BNIP3 L179S去极化突变体；里拉，LC3-相互作用区域；害虫，富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸的序列。B类PINK1和BNIP3变体的相互作用。对不同组合中表达PINK1-FLAG和Myc-tagged BNIP3变体（WT、ΔTM、H173A和L179S）的HEK293细胞进行分离，以分离细胞质(细胞)和线粒体(米托)然后是免疫沉淀(IP（IP）)带有反FLAG标签（用于检测PINK1），并使用抗BNIP3或抗PINK1(右侧面板). 输入控件显示在左侧面板。时间23和GAPDH公司线粒体标记和细胞溶质标记。C类，表达BNIP3变体的细胞线粒体形态。用抗Myc标记对表达Myc标记的BNIP3变体（WT、ΔTM、H173A和L179S）的HeLa细胞进行免疫染色(红色)或防TOM20(绿色). 用DAPI标记细胞核(蓝色). Colocalization显示在底部面板(合并). 注意，在表达WT和L179S的细胞中观察到明显的线粒体断裂。酒吧=10μm。天，64-kDa/55-kDa PINK1比率受BNIP3变体的影响。使用ImageJ测量线粒体部分的相对蛋白质水平，并通过单向方差分析和Dunnett检验进行分析。误差线，S.E。；n个= 4. *,第页< 0.05; **,第页< 0.01.E类，线粒体断裂定量。>每个实验中计数300个转染细胞。结果通过单因素方差分析和Dunnett检验进行分析。误差线S.E.公司。；n个= 3. ***,第页< 0.001.F类，表达BNIP3变体的细胞线粒体膜电位。通过TMRE染色检测线粒体膜电位，然后使用表达Myc-tagged BNIP3变体（WT、ΔTM、H173A和L179S）的HEK293细胞进行FACS分析。CCCP处理HEK293细胞（10μ米)2h为阳性对照。结果通过单因素方差分析和Dunnett检验进行分析。误差线S.E.公司。；n个= 4. *,第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001.
图3。
图3。
BNIP3促进PINK1非标准parkin向线粒体的募集。 A类，BNIP3诱导的全长PINK1位于MOM上。用蛋白酶K处理HEK293细胞中以不同组合表达PINK1-FLAG和Myc-BNIP3的线粒体，然后用FLAG标签（PINK1）、Myc标签（BNIP3）、MOM蛋白TOM20或IMM蛋白TIM23的抗体进行免疫印迹。B类，BNIP3促进parkin募集到去极化线粒体。用TOM20抗体对共表达parkin-GFP和Myc-BNIP3 WT或parkin-GPP和Myc-BBIP3ΔTM的HeLa细胞进行免疫染色(蓝色)或反Myc标签(红色). 对照组为仅表达parkin-GFP的细胞。细胞核如所示灰色。“合并”面板TOM20、Myc标签和GFP的共定位。酒吧=10μm。C类，线粒体parkin募集的定量。根据CCCP治疗实验，每组200个以上的细胞在线粒体上计数parkinB类结果通过单因素方差分析和Tukey检验进行分析。误差线S.E.公司。；n个= 3. ***,第页< 0.001.天将来自PINK1 KO小鼠或WT对照同窝小鼠的MEF与Parkin-GFP和Myc-BNIP3 WT联合转染，然后进行CCCP（20μ米)治疗。用TOM20抗体对细胞进行免疫染色(蓝色)或抗Myc标签(红色). 细胞核如所示灰色。“合并”面板TOM20、Myc标签和GFP的共定位。酒吧=10μm。E类，对线粒体上带有parkin的MEFs进行定量。从中所示的实验中，每组中有>100个细胞对线粒体上的parkin进行计数天。结果由双尾Student’s分析t吨测试。误差线S.E.公司。；n个= 3. **,第页= 0.0071.F类线粒体DNA含量。用空质粒转染WT和PINK1-缺陷（KO）HEK293细胞(控制)或Myc-BNIP3用CCCP（5μ米). 采用单因素方差分析和Tukey's检验检测和分析线粒体相对DNA含量（mtDNA/nDNA）。误差线S.E.公司。；n个= 4. *,第页< 0.05; ***,第页< 0.001.G公司，BNIP3促进PINK1介导的TIM23降解。按中所述处理的细胞F类用PINK1、BNIP3或TIM23抗体进行裂解和免疫印迹。β-肌动蛋白(底部面板)是装载控制。H（H），中所示实验中TIM23水平的量化G公司通过单因素方差分析和Tukey检验对受BNIP3影响的内源性TIM23的相对水平进行量化和分析。误差线、S.E.、。，n个= 4. *,第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001.我，自噬体吞噬线粒体的典型TEM图像。野生型对照(左侧面板)和PINK1缺陷(右侧面板)用Myc-BNIP3转染HEK293细胞，并用5μ米CCCP后进行TEM分析。请注意，每张图片中都显示了含有线粒体碎片样结构的自噬体。赖氨酸，溶酶体；辅助电源，自噬体；百万吨线粒体碎片。酒吧=100纳米。J型，中所示实验中类似有丝分裂结构的量化我大于0.72毫米2随机选取各组细胞区，计数其双膜吞噬线粒体样结构。结果通过单因素方差分析和Tukey检验进行分析。误差线S.E.公司。；n个= 3. *,第页< 0.05; **,第页< 0.01.
图4。
图4。
BNIP3 KO MEF中全长PINK1的积累、parkin向线粒体的募集和有丝分裂。 A类，CCCP在BNIP3 KO MEFs中诱导parkin募集到线粒体。用parkin-GFP转染BNIP3 KO和WT对照MEF，然后用对照溶剂（DMSO）或20μ米CCCP 6 h。用TOM20抗体对细胞进行免疫染色(红色). 细胞核用DAPI染色(蓝色). 派金染色(绿色)显示TOM20(“合并”面板). 这个插入在中“合并”面板显示同位化的放大图像。酒吧= 10 μ米.B类，BNIP3 KO MEF中的全长PINK1。用PINK1-FLAG转染BNIP3 KO和WT对照MEF，然后用20μ米CCCP持续0、2和12 h。用PINK1、TIM23或β-肌动蛋白抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。C类CCCP处理的BNIP3 KO MEF中的64-kDa/55-kDa PINK1比率。结果是三个独立实验的平均值，如B.误差条，代表S.E。天，CCCP处理的BNIP3 KO MEFs中TIM23的水平。结果是三个独立实验的平均值，如B.误差栏，代表S.E。
图5。
图5。
内源性BNIP3调节PINK1的分裂和有丝分裂。 A类，内源性BNIP3抑制PINK1切割并促进线粒体自噬。用PINK1-FLAG转染BNIP3 KO小鼠和WT对照窝鼠的MEF，然后在正常氧（21%O2,控制)或缺氧（5%O2,48小时)上调BNIP3。用PINK1、BNIP3或TIM23抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。β-肌动蛋白(底部面板)是装载控制。B类，PINK1 64-kDa/55-kDa片段的比率受内源性BNIP3的影响。PINK1 64和55-kDa片段在以下实验中的相对水平A类通过单因素方差分析和Tukey检验进行量化和分析。误差线S.E.公司。；n个= 4. **,第页< 0.01.C类，TIM23的量化受内源性BNIP3的影响。TIM23在中描述的实验中的相对水平A类通过单因素方差分析和Tukey检验进行量化和分析。误差线S.E.公司。；n个= 4. *,第页< 0.05; **,第页< 0.01.天，内源性BNIP3抑制内源性PINK1分裂并促进有丝分裂。HEK293细胞在低氧（5%O）下培养2)条件为0、12和24小时，然后用PINK1、BNIP3或TIM23抗体进行免疫印迹。β-肌动蛋白(底部面板)是装载控制。PINK1-FLAG转染细胞作为阳性对照。E类，量化内源性BNIP3影响的内源性PINK164-kDa/55-kDa比率。通过ImageJ测量内源性PINK1 64-和55-kDa片段受低氧诱导的BNIP3影响的相对水平，并通过单向方差分析和Dunnett检验进行分析。误差线S.E.公司。；n个= 3. *,第页< 0.05; **,第页< 0.01.F类，TIM23的量化受内源性BNIP3的影响。采用ImageJ法测定低氧诱导BNIP3对IMM蛋白TIM23相对水平的影响，并进行单因素方差分析和Tukey检验。误差线S.E.公司。；n个=3.*时，第页< 0.05; **,第页< 0.01.
图6。
图6。
BNIP3抑制粉红色1无效果蝇属. A类、翅膀姿势(上部两个面板)和胸部(下部两个面板)WT和粉红色1空突变体果蝇属表达其中之一mhc-加仑4(磁流体控制)或mhc-加仑4-被驱动的BNIP3型(磁流体控制>BNIP3型)如图所示。后视图(顶部面板)和侧视图(中上部面板)机翼姿态和光学显微图像(下部中间面板)扫描电子显微图像(底部面板)显示的是胸部。请注意BNIP3型表情抢救中的翅膀姿势异常和胸部缺陷粉红色1空苍蝇。B类，定量粉红色1BNIP3拯救的零诱导机翼姿态。>每个实验分析300只苍蝇。误差线S.E.公司。；n个= 3.C类，定量粉红色1null诱发的胸部缺损BNIP3型每个实验分析300只苍蝇。误差线S.E.公司。；n个= 3.天，救援粉红色1零诱导爬坡能力BNIP3型WT爬升指数（cm/s）和粉红色1空突变体果蝇属表达其中之一mhc-加仑4(磁流体控制)或mhc-加仑4-被驱动的BNIP3型(磁流体控制>BNIP3型)如图所示。每个实验对每个测试基因型确定>100只苍蝇的攀爬能力，并通过单因素方差分析和Tukey检验进行分析。误差线S.E.公司。；n个= 5.NS公司，无统计学意义；*，第页< 0.05; **,第页< 0.01.
图7。
图7。
BNIP3恢复线粒体形态和ATP生成粉红色1无效果蝇属. A类、有丝分裂生长因子(绿色)-WT和粉红色1空突变体果蝇属表达其中之一mhc-加仑4(磁流体控制)或mhc-加仑4-被驱动的BNIP3型(磁流体控制>BNIP3型)如图所示。请注意，线粒体聚集体见于粉红色1空蝇和肌肉特异性表达抑制BNIP3型(粉红色1无效的；磁流体控制>BNIP3型).酒吧=10μm。B类IFM中线粒体的TEM图像。WT和粉红色1空突变体果蝇属表达其中之一mhc-加仑4或mhc-加仑4-被驱动的BNIP3型(磁流体控制>BNIP3型)如图所示。酒吧=1微米。C类胸廓ATP生成。WT和粉红色1空突变体果蝇属表达其中之一mhc-加仑4或mhc-加仑4驱动BNIP3型(磁流体控制>BNIP3型)通过单向方差分析和Tukey检验进行测量和分析。误差线，代表S.E。；n个= 5. **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001. 请注意粉红色1空表达导致ATP生成减少，通过肌肉特异性表达BNIP3型.
图8。
图8。
BNIP3-PINK1交互示意图。 A类在正常条件下，合成全长PINK1（64kDa）并转运至线粒体。其线粒体靶向序列到达IMM，然后酶切产生55-kDa片段。55-kDa片段释放到细胞质中并最终降解。B类在压力下，BNIP3上调，并与PINK1相互作用，将全长PINK1（65 kDa）锚定在MOM上。MOM上的PINK1从细胞质中招募parkin来激活有丝分裂。汤姆，MOM复合物的易位酶；提姆，IMM复合物的转位酶；智能弹药系统线粒体膜间隙。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Kitada T.、Asakawa S.、Hattori N.、Matsumine H.、Yamamura Y.、Minoshima S.、Yokochi M.、Mizuno Y.和Shimizu N.（1998）parkin基因突变导致常染色体隐性遗传青少年帕金森综合征。自然392，605–608-公共医学
    1. Farrer M.J.（2006）《帕金森病遗传学：范式转变和未来展望》。Nat.Rev.基因。7, 306–318-公共医学
    1. Valente E.M.、Abou-Sleiman P.M.、Caputo V.、Muqit M.M.、Harvey K.、Gispert S.、Ali Z.、Del Turco D.、Bentivoglio A.R.、Healy D.G.、Albanese A.、Nussbaum R.、González-Maldonado R.、Deller T.、Salvi S.等人（2004），PINK1突变引起的遗传性早发性帕金森病。科学304，1158–1160-公共医学
    1. Muqit M.M.、Abou-Sleiman P.M.，Saurin A.T.、Harvey K.、Gandhi S.、Deas E.、Eaton S.、Payne Smith M.D.、Venner K.、Matilla A.、Healy D.G.、Gilks W.P.、Lees A.J.、Holton J.、Revesz T.等人（2006）在蛋白酶体应激下改变PINK1的裂解和定位为聚集体。神经化学杂志。98, 156–169-公共医学
    1. Lin W.和Kang U.J.（2008）PINK1加工、稳定性和亚细胞定位的表征。神经化学杂志。106, 464–474-项目管理咨询公司-公共医学