Retinal Hypercholesterolemia Triggers Cholesterol Accumulation and Esterification in Photoreceptor Cells

doi:10.1074/jbc.M116.744656

.2016年9月23日；291(39):20427-39.

doi:10.1074/jbc。M116.744656。 Epub 2016年8月11日。

视网膜高胆固醇血症触发感光细胞中胆固醇的积累和酯化

艾恰·萨达内¹, 纳塔利亚桅杆¹, 东道¹, 贝塞尔·艾哈迈德², 伊琳娜·皮库莱娃^三

附属公司

¹来自俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学眼科和视觉科学系。
²来自俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学眼科和视觉科学系以及俄亥俄州克利夫兰大学医院44106。
^三来自俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学眼科和视觉科学系iap8@case.edu。

PMID： 27514747
预防性维修识别码：项目5034040
内政部： 10.1074/jbc。M116.744656号

视网膜高胆固醇血症触发感光细胞中胆固醇的积累和酯化

艾恰·萨达内等。生物化学杂志. 2016.

.2016年9月23日；291(39):20427-39.

doi:10.1074/jbc。M116.744656。 Epub 2016年8月11日。

作者

艾恰·萨达内¹, 纳塔利亚桅杆¹, 东道¹, 贝塞尔·艾哈迈德², 伊琳娜·皮库莱娃^三

附属公司

¹来自俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学眼科和视觉科学系。
²来自俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学眼科和视觉科学系以及俄亥俄州克利夫兰大学医院44106。
^三来自俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学眼科和视觉科学系iap8@case.edu。

PMID： 27514747
预防性维修识别码：下午034040
内政部： 10.1074/jbc。M116.744656号

摘要

没有感光细胞，视觉过程是不可能的，感光细胞具有独特的结构和特定的胆固醇维持功能。在此，我们报告了在Cyp27a1（-/-）Cyp46a1（-/-）小鼠的后续特征研究中发现的视网膜中先前未被识别的胆固醇相关通路。这些动物患有视网膜高胆固醇血症，并将过量的视网膜胆固醇转化为胆固醇酯，通常在视网膜中以极少量存在。我们确定，在Cyp27a1（-/-）Cyp46a1（-/-）视网膜中，胆固醇酯由光感受器外段（OS）生成并积聚在其内，后者是胆固醇含量最低的视网膜层。小鼠OS也表达胆固醇酯化酶酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶（ACAT1），但不表达卵磷脂胆固醇酰基转移酶（LCAT），并且ACAT1的视网膜表达与人类不同。然而，胆固醇酯在人类OS中含量丰富。我们提出了OS中胆固醇酯积聚的机制，并且人类ACAT1活性受损可能是视网膜下类核糖沉积形成的基础，这是年龄相关性黄斑变性的标志，是一种常见的致盲性疾病。我们生成了Cyp27a1（-/-）Cyp46a1（-/-）Acat1（-/-）小鼠，通过不同的成像方式对其视网膜进行了表征，并证实了未酯化胆固醇确实在其OS中积聚，并且该系中存在感光细胞凋亡和OS变性。我们的结果揭示了视网膜对局部高胆固醇血症的反应以及胆固醇酯化的视网膜意义，胆固醇酯化可能是细胞特异性的，对视网膜结构和功能既有利又有害。

关键词：乙酰辅酶A（acetyl-CoA）；胆固醇；胆固醇代谢；细胞色素P450；眼睛；气相色谱-质谱（GC-MS）；发病机制；视网膜；视网膜变性；视网膜代谢。

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数字

**图1。**
**不同基因型小鼠EC和UC的视网膜含量。** A类，的*Cyp27a1细胞*^+/+*Cyp46a1细胞*^+/+和*Cyp27a1细胞*^−/−*Cyp46a1细胞*^−/−线；B类，的*交流1*^+/+和*交流1*^−/−线；和C类，的*Cyp27a1细胞*^−/−*Cyp46a1细胞*^−/−*交流1*^−/−行。在所有基因型中，除了*Cyp27a1细胞*^−/−*Cyp46a1细胞*^−/−*交流1*^−/−女性，结果为“n个“就是动物的数量。在*Cyp27a1细胞*^−/−*Cyp46a1细胞*^−/− *交流1*^−/−雌性，结果是重复测量的平均值：UC为35和36nmol/mg蛋白质；EC的0.6和0.5 nmol/mg蛋白质。收集4-7个月大的小鼠（每个小鼠取两个视网膜）的视网膜样本，在*Cyp27a1细胞*^+/+*Cyp46a1细胞*^+/+和*Cyp27a1细胞*^−/−*Cyp46a1细胞*^−/−基因型。单个视网膜，即每只3-5个月大的小鼠的一个视网膜，用于所有其他基因型的测量。*Cyp27a1细胞*^+/+*Cyp46a1细胞*^+/+和*Cyp27a1细胞*^−/−*Cyp46a1细胞*^−/−小鼠在C57BL/6J上；129S6/SvEv背景。*交流1*^+/+和*交流1*^−/−小鼠为C57BL/6J背景。上的数据*Cyp27a1细胞*^+/+*Cyp46a1细胞*^+/+和*Cyp27a1细胞*^−/−*Cyp46a1细胞*^−/−基因型取自参考文献**，第页< 0.01; ***,第页<0.001（学生）t吨测试。*黑色星号*和*水平线*指出总胆固醇的统计意义；*灰色星号*和*水平线*指出非酯化胆固醇的统计意义。

**图2。**
**用filipin组织化学检测视网膜EC。**菲林是一种荧光抗生素，与UC和其他甾醇的3β-羟基相互作用。这使得用70%的水乙醇进行组织预处理以提取UC，然后用胆固醇酯酶释放剩余EC中的3β-羟基后，EC可以可视化*左侧部分*在每个面板是相位对比度图像*右侧部分*是一种组织化学图像。A类和D类控制污渍，确保UC去除的完整性。这些切片用乙醇提取并用菲利平处理。B类和E类，控制背景荧光染色。这些切片是用乙醇提取的，但没有用鱼肝素或胆固醇酯酶处理。C类和F类，EC染色。这些切片用乙醇提取，然后依次用胆固醇酯酶和filipin处理。所有图像都具有代表性：n个=3只小鼠（3-7个月大）/基因型，每只小鼠有一个视网膜。*比例尺*：100微米。

**图3。**
**小鼠和人类PR细胞中UC和EC含量。** A类，小鼠视网膜。结果是来自一个视网膜的三个样本的测量值的平均值±S.D.，每个样本包含四个PR区域的解剖。B类和C类，人类视网膜。结果是来自一个视网膜的两个样本的测量平均值，每个样本包含四个解剖体（供体1和2），以及一个样本，每个样本中包含600-700次激光照射的材料（供体3-6）。这个数字在内部*蓝色条*是相对于总胆固醇的EC含量。捐赠者3-6的总胆固醇数据之前发表在参考文献中。

**图4。**
**视网膜光感受器外段和视网膜色素上皮中的脂质积聚*Cyp27a1细胞*^−/−*Cyp46a1细胞*^−/−老鼠。**透射电子显微照片*Cyp27a1细胞*^+/+*塞浦路斯46a1*^+/+老鼠(A类和E类)和*Cyp27a1细胞*^−/−*Cyp46a1细胞*^−/−老鼠(*B–D类*和*F–I型*).C类,*G公司*、和*H（H）*,*放大的图像*的*装箱区域*在里面B类和F类分别是。B类，单个脂滴(*黄色圆圈*)和一簇脂滴(*洋红色圆圈*).C类，外节无质膜(*橙色箭头*).D类，脂滴的线性轨迹(*深蓝色箭头*)表明这些脂滴正从外节排出。*F–H（飞行高度）*、含有膜碎片和膜颗粒的含脂区域(*黄色方框区域*和*黄色箭头*或脂滴簇(*洋红色框区域*和*洋红色箭头*）。*G公司*和我，吞噬体(*蓝色箭头*)，其中一个(我)含有脂滴。我，一个脂类湖(*紫色箭头*). 所有图像都具有代表性：n个=3只小鼠（7个月大）/基因型，每只小鼠有一个视网膜。*比例尺*:A类,B类、和我，2微米；C类0.5微米；D类0.2微米；E类和F类，5微米；*G公司*和*H（H）*，1微米。

**图5。**
**搜索特定ACAT1抗体。** A类Western blotting分析评估不同供应商ACAT1抗体的特异性。视网膜匀浆*交流1*^−/−（阴性对照）和*阿卡特1*^+/+小鼠（3-4个月大）在SDS-PAGE上并排奔跑。转移和封闭后，用来自Sigma、Novus、Abcam和Santa Cruz Biotechnology的一级抗体分别切割和探测膜。ACAT1的免疫反应信号位于红色GAPDH（用作加载控制）的绿色Sigma、Novus和Santa Cruz Biotechnology的初级抗体在来自*交流1*^−/−和*交流1*^+/+小鼠和识别出分子量不同于全尺寸ACAT1（～64 kDa）的蛋白质。只有来自Abcam的一级抗体在两种病毒中均未显示ACAT1免疫反应性*交流1*^−/−和*交流1*^+/+视网膜匀浆。B类比较来自Sigma、Novus、Santa Cruz Biotechnology和Abcam的抗ACAT1抗体的特异性，通过对照菌株和未免疫的(镍)血清与二级抗体(2^o个)和免疫组织化学染色*交流1*^−/−视网膜切片。细胞核用DAPI染色（in蓝色). 只有来自圣克鲁斯生物技术和Abcam的初级抗体对ACAT1没有任何免疫反应性。因为来自Abcam的一级抗体在*阿卡特1*^−/−视网膜匀浆，选择此抗体在不同基因型小鼠的视网膜切片上进行进一步测试。C类，用二级抗体控制染色，用来自Abcam的一级抗体对ACAT1进行视网膜免疫定位*Cyp27a1细胞*^−/−*Cyp46a1细胞*^−/−小鼠（6-8个月大）。细胞核用DAPI染色（in蓝色).放大的图像的*装箱区域*也显示了。冰冻视网膜切片中只观察到微弱的点状信号，主要定位于OS，IS中有少量点状免疫反应。视网膜石蜡切片显示出更强的抗ACAT1免疫反应，仅定位于OS。*比例尺*100微米。

**图6。**
**ACAT1和LCAT在小鼠视网膜的免疫定位。** A类,D类,我、和我，用未免疫的药物控制染色(镍)血清；和B类,E类,J型、和*M（M）*，次要(2^o个)抗体。细胞核用DAPI染色（in蓝色).C类和*K（K）*，ACAT1污渍（英寸绿色);F类和N个，LCAT（英寸红色); 和*G公司*和*O（运行）*，谷氨酰胺合成酶（in绿色).H（H）和*P（P）*,*覆盖层*属于F类和*G公司*和N个和*O（运行）*分别是。用Alexa Fluor 647-结合二抗检测ACAT1和LCAT的免疫反应性，用Alexa-Fluor 488二抗检测GS的免疫反应。所有图像都具有代表性：n个=3只小鼠（6-8个月大）/基因型，每只小鼠有一个视网膜。*比例尺*：50微米。

**图7。**
**人类视网膜ACAT1和LCAT的免疫定位。**这个左边和*右侧部分*在每个面板分别是相位对比图像和组织化学图像。A类,D类,*G公司*、和J型，用未免疫的药物控制染色(镍)血清；和B类,E类,*H（H）*、和*K（K）*，次要(2^o个)抗体。细胞核用DAPI染色（in蓝色).C类和*F、，*ACAT1的污渍（英寸绿色); 和我和我，LCAT（英寸红色). Alexa Fluor 647结合二抗检测免疫反应性。F类,*黄色星号*指示德鲁森。所有图像都具有代表性(n个=5名捐赠者）。黄斑部和周边视网膜的切片来自同一供体。*比例尺*：50微米。

**图8。**
**转基因小鼠的视网膜异常。**视网膜SD-OCTCyp27a1细胞^−/−*Cyp46a1细胞*^−/−*交流1*^−/−(A类和C类),*Cyp27a1细胞*^+/+*塞浦路斯46a1*^+/+*交流1*^+/+(B类和D类),*Cyp27a1细胞*^−/−*Cyp46a1细胞*^−/−(E类)、和*Cyp27a1细胞*^+/+*Cyp46a1细胞*^+/+(F类)老鼠。同一只老鼠在A类和C类. The白色箭头在里面B类指向几乎不存在的低反射带A类和C类。所有图像都具有代表性(n个=3只小鼠/基因型）。*G公司*经Zweifel许可拍摄的人视网膜视网膜下类核糖形成的阶段等. (15).比例尺:*A–F*，100微米。

**图9。**
**视网膜表现*Cyp27a1细胞*^−/−*Cyp46a1细胞*^−/−*交流1*^−/−缺乏。** A类和*G公司*，代表(n个=3只小鼠的6只眼睛/基因型）5.5个月大的视网膜SD-OCTCyp27a1细胞^+/+*Cyp46a1细胞*^+/+*交流1*^+/+和*Cyp27a1细胞*^−/−*Cyp46a1细胞*^−/−*交流1*^−/−小鼠分别表现出后者全视网膜厚度减少(*长竖条*)和RPE外部限制膜的厚度(*ELM公司*)地区(*短竖条*). 两者都有*Cyp27a1细胞*^+/+*Cyp46a1细胞*^+/+（C57BL/6J；129S6/SvEv背景）和*交流1*^+/+小鼠（C57BL/6J株）具有相同的视网膜厚度。B类和*H（H）*RPE-ELM区域厚度的量化。结果是6只眼/3只小鼠/基因型的鼻和颞视网膜（距视神经400μm）测量值的平均值±S.D.。***，第页<0.001（学生）t吨测试。*C–F类*和*I–L型*，中的动物A类和B类分别用于H&E组织学评估(C类和我)和抗视紫红质(D类和J型，英寸红色)、隧道(E类和*K（K）*，英寸青色)和UC被filipin染色(F类和我，英寸青色). 细胞核用DAPI染色（in蓝色). 用Alexa Fluor 555结合二级抗体检测免疫反应性。所有图像都具有代表性(n个=3只小鼠/基因型）。*比例尺*：50微米。

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