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.2016年8月22日；213(9):1741-57.
doi:10.1084/jem.20151095。 Epub 2016年8月8日。

ADAM10的激活形式具有肿瘤选择性，并调节肿瘤干细胞和肿瘤生长

Lakmali Atapattu公司 1, 纳亚恩杜·萨哈 2, Chanly Chheang公司 1, 莫里茨·F·艾斯曼 三, 徐凯（Kai Xu） 2, 玛丽·E·维尔 1, 琳达·海 1, 卡门·勒雷纳 1, 刘占奇 4, 卡贾·霍维 5, 海伦·E·阿布德 5, 乌尔里克·库斯巴赫 6, 罗伯特·莫里茨 6, 毕森鼎 7, 曹忠伟 7, 沙欣·拉菲伊 7, 马蒂亚斯·恩斯特 三, 安德鲁·斯科特 4, 迪米塔尔·尼古洛夫 2, 马丁·莱克曼 1, 彼得·琼斯 8
附属公司

ADAM10的激活形式具有肿瘤选择性，并调节肿瘤干细胞和肿瘤生长

Lakmali Atapattu公司等。 实验医学杂志. .

摘要

跨膜金属蛋白酶ADAM10释放一系列细胞表面蛋白，包括Notch、Eph和erbB家族的配体和受体，从而激活对肿瘤启动和维持至关重要的信号通路。因此ADAM10是一个很有前景的治疗靶点。尽管其表达广泛，但其活动通常受到严格监管。我们现在报告了一种活性形式的ADAM10在肿瘤中的流行率，与正常组织、小鼠模型和人类的ADAM1活性形式相比，ADAM10活性形式由我们的构象特异性抗体mAb 8C7鉴定。结构/功能实验表明，mAb 8C7结合一种活性构象，这种构象依赖于肿瘤中常见的二硫键异构化和氧化条件。此外，这种活性ADAM10形式标记具有活性Notch信号的癌干样细胞，已知其可介导化疗耐药性。重要的是，8C7对活性ADAM10的特异性靶向抑制小鼠模型中的Notch活性和肿瘤生长，特别是化疗后的再生。我们的结果表明，活性ADAM10的靶向抑制是ADAM10依赖性肿瘤发展和耐药性的潜在治疗方法。

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数字

图1。
图1。
抗ADAM10单抗8C7在肿瘤中优先结合ADAM10。（A） 预先注射Alexa标记的8C7或IgG对照物（100µg，48 h前）和罗丹明凝集素（15 min前）的小鼠LIM1215异种移植瘤切片的免疫荧光共聚焦显微镜。8C7结合（绿色）在血管（用罗丹明凝集素标记，红色）和肿瘤边缘（用虚线标记）附近最强。Hoechst染色显示细胞核（蓝色）。（B） 在预先注射100µg Alexa标记的8C7或对照ADAM10抗体MAB946（两种抗体都能识别人类和小鼠ADAM10）或IgG对照前48小时，对小鼠的肿瘤和组织切片进行荧光显微镜检查。（A和B）标尺以微米为单位。（C） 通过注射1 mg 8C7或PBS（顶部）的荷瘤小鼠组织裂解液中的蛋白A Sepharose回收的8C7-结合ADAM10的WB分析。底部面板显示了通过IP/WB和识别小鼠和人类ADAM10（Abcam pAb 39177）的对照抗体和裂解物负载控制（GAPDH）的ADAM10的整体表达。HMW ADAM10在肿瘤中普遍存在。星号表示8C7和PBS注射小鼠的脾脏中都有一个非特异性带。bd c，8C7-珠-仅控制。面板显示了代表三个独立实验的数据。
图2。
图2。
单抗8C7在肿瘤中优先结合ADAM10的活性形式。（A） 从LIM1215人肿瘤细胞或小鼠胚胎成纤维细胞（MEF；如黑线所示，去除不相关通道）的裂解液中，含有抗ADAM10 mAbs 8C7和4A11或同种匹配IgG对照物的免疫沉淀物。（B） 人类大肠肿瘤（tum）或与8C7或对照ADAM10 mAb 4A11匹配的正常（正常）组织样本中的ADAM10免疫沉淀物，对ADAM10进行Western blotted（顶部面板表示更长的暴露时间）。以GAPDH的总裂解产物作为负荷控制。图表显示了每个样品中HMW和LMW ADAM10条带的相对水平（平均值±SEM；n个= 3; *, 未配对双尾学生的P<0.05t吨测试）。（C） ADAM10的HMW形式存在于细胞表面。将完整的LIM1215细胞与8C7或4A11在37°C或抑制内吞作用的条件下培养（在冰上或存在0.4 M蔗糖）。清洗并裂解细胞，并添加蛋白A珠以下拉结合单克隆抗体的ADAM10。样品用α-ADAM10 pAb进行WB分析。（D） 呋喃处理证实HMW ADAM10未经处理。将LIM1215裂解物中的8C7和4A11 IP用重组呋喃处理1h，并用α-ADAM10 pAb和ADAM10前域特异性抗体对样品进行WB分析。（E） 使用切割后发出荧光的猝灭荧光肽底物（FRET分析；平均值±SEM；n个=3个实验；*，P=0.05；***，非配对双尾学生的P<0.001t吨测试）。在左侧面板中，免疫沉淀物被调整为具有相似水平的ADAM10，并且活性相对于ADAM10水平（底部面板，任意单位）来表达。对于肿瘤样品（右），IP来自总蛋白相等的裂解物，并显示了相对活性和总活性。（F） 处理不会更改ADAM10活动。用重组Furin（20 U/ml，1 h）处理来自全细胞LIM1215裂解物的8C7 IP，或在使用淬灭的荧光肽底物检测ADAM10脱酶活性之前不处理。活性是相对于ADAM10水平测定的，如E（平均值±SEM；n个= 3). （G） LIM1215细胞的连续IP与4A11和8C7裂解。顶部面板显示ADAM10的WB从初始降水中恢复；底部面板显示了剩余预处理上清液的后续沉淀，如图所示。所有数据均代表至少两个独立实验。
图3。
图3。
8C7F（ab′）的晶体结构2/ADAM10 D+C复合体。（A） 8C7单抗的重链为洋红色，轻链为青色。ADAM10的去整合素和富含半胱氨酸的结构域呈绿色。ADAM10中的二硫化物桥被画成棒状，并被涂成黄色。糖基化部分绘制为灰色球体。结合在ADAM去整合素结构域中的钙离子呈蓝色。ADAM10 D+C/8C7 F（ab′）有两份副本2不对称单元中的碎片络合物，对于557个Cα原子，其r.m.s.d.几乎相同，为0.62°。（B） 8C7/ADAM10接口的两个特写视图。右面板视图是从左面板视图旋转60度的视图。8C7单抗的重链为洋红色，轻链为青色，ADAM10为绿色。相互作用的残留物被画成棍子，并在右侧面板上贴上标签。与ADAM10接触的8C7分子表面在右侧面板上呈现为灰色。（C） ADAM10/Mab复合结构突出了结合8C7相对于CxxC基序位置的位置。（D） 8C7/ADAM10界面特写显示ADAM10中的相互作用残基（红色），包括C639，它与CxxC基序的C594形成二硫键（黄色）。8C7F（ab′）的填充表示2显示为（洋红色）。底部的序列比对显示了在我们的ADAM10结构中观察到的二硫键（黑线）和根据ADAM17实验预测的交替二硫模式（蓝线）（Düsterhöft等人，2013）。保存的残留物用黄色突出显示，半胱氨酸放在红色方框中。
图4。
图4。
8C7与ADAM10的结合取决于CxxC基序和氧化还原条件。（A） ADAM10 CxxC基序突变阻断8C7的结合，但不控制单克隆抗体。WT和AxxA突变体hADAM10转染到ADAM10−/−用8C7和商业（R&D Systems MAB1427）抗ADAM10抗体和WB通过IP分析小鼠胚胎成纤维细胞和裂解物。（B） 8C7与ADAM10的结合受到氧化还原条件的调节。用还原剂（DTT）、氧化剂（H2O（运行）2)或EGF或Eph RTK刺激（分别用EGF或ephrin-A5[EfnA5]）。用8C7或对照单抗4A11从细胞裂解液中免疫沉淀ADAM10，并进行WB分析。图表显示平均值±SEM；n个=6个实验；*，P<0.05；**，P<0.01；***，一个样本的P<0.001学生t吨相对于对照的测试。（C） 流式细胞术检测未经处理或用100 ng/ml EGF或1 mM H处理的细胞中Alexa标记的8C7和4A11与LIM1215细胞表面ADAM10的结合2O（运行）230分钟。图表显示了标准化到控制单元的绑定；平均值±SEM；n个=3个实验；*，单样本学生的P<0.05t吨相对于对照的测试。（D） 肿瘤中的8C7-靶向细胞具有高活性氧生成。向LIM1215异种移植物小鼠注射100µg（6.7 mg/kg）Alexa647-标记为8C7，肿瘤恢复，8C7-Alexa647FACS对–阳性和–阴性细胞进行分类。然后通过Amplex红试验分析相同细胞数的ROS生成。图表显示平均值±SEM；n个=4个实验；**，P=0.001（未配对学生）t吨测试。（E） PDI治疗暴露出不稳定的二硫键半胱氨酸。用甲基-PEG12-马来酰亚胺（MPM）处理来自LIM1215细胞裂解物的ADAM10 IP以阻断游离半胱氨酸，然后用PDI（5µg/ml）或DTT（20µM）作为阳性对照，然后用MPB处理。WB分别用链霉亲和素HRP和α-ADAM10抗体检测生物素化和总ADAM10水平。未经MPB处理。（F） PDI与细胞内8C7-结合的ADAM10相关。用PDI或ADAM10抗体对含有8C7、4A11或对照单克隆抗体的LIM1215细胞裂解物中的IP进行免疫印迹。（B和F）黑线表示中间车道已拼接。
图5。
图5。
8C7识别的活性ADAM10优先标记具有活性Notch信号的癌干样细胞。（A） 注射Alexa一次的小鼠LIM1215肿瘤切片6478C7（100µg，亚治疗剂量）和罗丹明-凝集素与抗肿瘤干细胞标记物CD133或裂解（活性）Notch1或Notch2胞内结构域（NICD1,2）或EpCam的抗体共染色。深蓝色表示核染色。插图显示对照组、非8C7注射小鼠肿瘤的高倍图像，显示NICD染色的特异性和与核染色的共定位；嵌入式钢筋，10µm。箭头表示8C7和EpCam染色的共定位。（B） 通过FACS对分散的肿瘤细胞进行CD133表达分类，并从相等数量的CD133中分离裂解物+/−WB分析细胞活性Notch1（NICD1）。（C） 对A的肿瘤切片进行Notch配体Jagged1共染色。数据代表至少两个独立实验。（A和C）比例尺以微米为单位。
图6。
图6。
8C7抑制肿瘤细胞中的Notch信号。（A） 小鼠LIM1215肿瘤蛋白提取物(n个=4）用PBS（对照组）或8C7或对照IgG（67 mg/kg）治疗3周后，用抗NICD或肌动蛋白抗体作为负荷对照（#IgG带）进行WB分析。图中显示了NICD水平相对于Notch1的定量（无显著性差异）。（B） 采用实时PCR分析A组小鼠LIM1215肿瘤的RNA提取物，以检测Notch靶点Hes1的表达（归一化为平均对照）。（C） 小鼠肿瘤(n个=3）用抗NICD1抗体对A组进行染色，并对整个肿瘤切片或阳性染色区域（～10/切片）的阳性细胞核计数进行量化。图像显示阳性染色的代表性区域，包括血管样结构周围。A–C中的图表显示平均值±SEM(n个= 4); *, P<0.05；**，非配对双尾学生的P<0.01t吨测试。（D） 来自溶媒对照和8C7处理小鼠的近端小肠(n个=7）分析Ki67和NICD的表达（通过IHC）和Olfm4（通过原位杂交）。（C和D）比例尺以微米为单位。（E） 对小鼠小肠RNA提取物进行定量PCR分析，如D所示，显示所示标记的表达（相对于平均对照）。（D和E）图表显示平均值±SEM(n个= 7); n.s.，非配对双尾学生的无显著性t吨测试。（F） 从LIM1215肿瘤异种移植物中回收的肿瘤细胞进行分类，进行抗CD133染色阴性，并保存在培养基中。然后在8C7（20或100µg/ml）、对照IgG（100µg/ml）、GSI（10µM）或溶媒对照物存在下添加HUVEC 30分钟。如图所示，回收细胞裂解液并用WB进行分析。黑线表示中间车道已拼接。图中显示了活性Notch1（NICD1）相对于对照组的水平（平均值±SEM；**，非配对双尾学生的P<0.01t吨试验[8C7 vs.对照IgG]；n个=3个实验）。（G） 8C7抑制Notch依赖性淋巴瘤细胞增殖。从Eμ-Myc小鼠（红色）和表达Jagged1（EC，绿色）的E4ORF1转导的HUVEC分离的淋巴瘤细胞共培养物在无血清条件下，在5µg/ml 8C7或对照IgG存在下生长5 d，并随时间进行计数。单独培养的淋巴瘤细胞作为对内皮细胞依赖性的对照（红线；n个= 3). 棒，50µm。
图7。
图7。
8C7抑制小鼠LIM1215肿瘤的生长。（A–C）用8C7单克隆抗体（33或67 mg/kg）或PBS对照治疗携带LIM1215人类肿瘤的小鼠(n个= 8). （A） 肿瘤体积。（B） 最终肿瘤重量。（C）最终小鼠重量。（D） 用67 mg/kg 8C7或同型匹配的对照单克隆抗体（IgG）重复A中的实验，显示8C7的特异作用(n个= 3). （E） 内皮细胞（α-CD31）染色显示8C7治疗的肿瘤血管减少。（F） TUNEL染色显示8C7治疗后肿瘤细胞凋亡增加，尤其是在血管化肿瘤边缘。（E和F）标尺以微米为单位。（G） 对单个肿瘤（八个/治疗组）的裂解物进行WB分析表明，8C7治疗的肿瘤中Notch受体、EphA2和MET的表达下调。图表显示平均值±SEM；*，P<0.05；**，P<0.01；***，双尾学生的P<0.001t吨测试（8C7 vs.PBS）。数据是三个独立实验的代表。
图8。
图8。
8C7抑制gp130中的自发肿瘤生长前/后敲入小鼠。（A） gp130胃组织中ADAM10的8C7免疫沉淀物前/后敲除小鼠在5-6周龄时发生自发性胃肠道肿瘤。显示了胃不同部位的样本；F、 眼底；C、 语料库；A、 胃窦；T、 肿瘤。注意HMW ADAM10在5-6周时出现，但在WT小鼠（6周）中没有出现。（B） 从3周龄开始，每周给小鼠服用两次8C7(n个=10），PBS(n个=9），或控制IgG(n个=7），使用四个单独实验中的同窝婴儿。在8周时评估肿瘤负荷、小鼠体重和脾脏重量。图表显示平均值±SEM。（C）8C7-或对照IgG处理小鼠的肿瘤切片(n个=4）通过活性切迹（NICD1）染色进行分析。图表显示了使用10个图像/处理的平均值±SEM。比例尺以微米为单位。（D） gp130肿瘤Hes1的RT-PCR分析前/后用8C7或对照IgG治疗的小鼠（平均值±SEM，n个=4）归一化为PBS处理。对于所有图表，*，P<0.05；**，P<0.01；***，未配对、双尾学生的P<0.001t吨测试。
图9。
图9。
8C7与化疗联合使用最有效。（A） 单用伊立替康（三次注射，箭头）或连续8C7治疗（红色，1 mg）或单用PBS（绿色）治疗LIM1215肿瘤异种移植物的肿瘤体积。图表显示了随时间测量的平均肿瘤体积（使用SEM）(n个≥ 5). （B） A.（C）小鼠肿瘤恢复重量CD133的百分比+从按A处理的小鼠中回收的肿瘤细胞(n个≥5）用抗CD133抗体进行FACS评估。（B和C）图表显示平均值±SEM；**，非配对双尾学生的P<0.01t吨测试。数据是三个独立实验的代表。
图10。
图10。
8C7不抑制ADAM10底物结合，但可能取代其MP结构域。（A） 8C7结合的ADAM10显示出与Notch受体底物的优先结合。来自具有8C7和4A11的LIM1215裂解物的IP，通过WB平衡ADAM10水平，用针对所述蛋白质的抗体印迹。图中显示了共沉淀蛋白与通过密度测定定量的总ADAM10水平之间的比率（三个独立实验的平均值±SEM；*，P<0.05；**，P<0.01，通过单样本Student’st吨与4A11结合相关的测试）。（B） 8C7/ADAM10 D+C结构与相关蛇毒MP全长结构的比较表明，MP结构域的定位与8C7结合相似，表明可能存在竞争。
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