A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart

doi:10.1161/CIRCRESAHA.116.309202

.2016年9月30日；119(8):909-20.

doi:10.1161/CIRCRESAHA.116309202。 Epub 2016年8月8日。

一种从成年小鼠心脏同时分离存活心肌细胞和非心肌细胞的简化无朗格多夫方法

马修·阿克斯-约翰逊¹, 李一清（Peter Yiqing Li）¹, 安德鲁·福尔摩斯¹, Sian-Marie O'Brien先生¹, 达沃尔·帕夫洛维奇¹, 罗杰·福²

附属公司

¹来自新加坡国立大学卫生系统转化医学中心MD6心血管研究所（M.A.-J.，P.Y.L.，R.S.F.）；新加坡基因组研究所（M.A.-J.，R.S.F.）；以及英国伯明翰大学心血管科学研究所（A.P.H.，S.-M.O.，D.P.）。
²来自新加坡国立大学卫生系统转化医学中心MD6心血管研究所（M.A.-J.，P.Y.L.，R.S.F.）；新加坡基因组研究所（M.A.-J.，R.S.F.）；以及英国伯明翰大学心血管科学研究所（A.P.H.，S.-M.O.，D.P.）。mdcrfsy@nus.edu.sg。

PMID： 27502479
预防性维修识别码： PMC5965670
内政部： 10.1161/CIRCRESAHA.116309202号

一种从成年小鼠心脏同时分离存活心肌细胞和非心肌细胞的简化无朗格多夫方法

马修·阿克斯-约翰逊等。循环研究. 2016.

.2016年9月30日；119(8):909-20.

doi:10.1161/CIRCRESAHA.116309202。 Epub 2016年8月8日。

作者

马修·阿克斯-约翰逊¹, 李一清（Peter Yiqing Li）¹, 安德鲁·福尔摩斯¹, 肖恩·玛丽·奥布莱恩¹, 达沃·巴甫洛维奇¹, 罗杰·斯福²

附属公司

¹来自新加坡国立大学卫生系统转化医学中心MD6心血管研究所（M.A.-J.，P.Y.L.，R.S.F.）；新加坡基因组研究所（M.A.-J.，R.S.F.）；以及英国伯明翰大学心血管科学研究所（A.P.H.，S.-M.O.，D.P.）。
²来自新加坡国立大学卫生系统转化医学中心MD6心血管研究所（M.A.-J.，P.Y.L.，R.S.F.）；新加坡基因组研究所（M.A.-J.，R.S.F.）；以及英国伯明翰大学心血管科学研究所（A.P.H.，S.-M.O.，D.P.）。mdcrfsy@nus.edu.sg。

PMID： 27502479
预防性维修识别码： PMC5965670
内政部： 10.1161/CIRCRESAHA.116309202号

摘要

理论基础：心血管疾病是一种全球性的流行病。小鼠基因组学、表观基因组学和转基因的出现和最新进展为强大的研究途径提供了更大的潜力。然而，进展往往受到与从成年小鼠心脏分离活心肌细胞相关的独特复杂性的限制。目前的治疗方案依赖于使用专用Langendorff装置的逆行主动脉灌注，这给研究人员带来了相当大的后勤和技术障碍，并且需要大量的培训投资。

目标：确定并优化一种方便的替代方法，仅使用普通外科和实验室设备即可对成年小鼠心肌细胞进行强有力的分离和培养。

方法和结果：采用体外LV直接针头灌注法分离心肌细胞，其产量与已发表的基于朗格多夫的方法相当，无需肝素注射。分离的心肌细胞可以无抗生素培养，保留有组织的收缩和线粒体形态、转录特征、钙处理、对缺氧的反应、神经激素刺激和电起搏，并且适合膜片钳和腺病毒基因转移技术。此外，该方法允许同时分离、分离和共培养心肌细胞和非心肌细胞心脏群体。

结论：我们提出了一种新的简化方法，证明了从同一成年小鼠心脏同时分离出存活心肌细胞和非心肌细胞。我们预计，这种新方法将扩大和加速心脏生物学领域的创新研究。

关键词：无朗格多夫；心脏成纤维细胞；心肌细胞；心血管疾病；共培养；小鼠模型；单细胞隔离。

PubMed免责声明

数字

**图1。一种从成年小鼠心脏分离心肌细胞的新方法。**
图解说明该方法原理的示意图，在该方法中，传统的基于朗格多夫的逆行主动脉灌注被简单的游离缓冲液注入左心室所取代(A类). 止血主动脉夹的应用迫使缓冲液通过（蓝色箭头；B)通过冠状动脉循环（红色），确保心肌的深度灌注。

**图2。心肌细胞分离方案总结。**
在线数据补充中提供了方法的详细扩展描述，包括图像和视频。LV表示左心室。

**图3。方案优化和高产存活心肌细胞的分离。**
A类–C类，成年小鼠左心室消化产物的典型图像，电镀前(A类)，培养1小时后(B和C类)显示80%的杆状活肌细胞产量，有组织的肉质条纹。比例尺=100μm。D类，解离缓冲液pH值的优化。在pH值7.8时可获得最高活产率。EDTA浓度为1 mmol/L。E类，EDTA浓度优化。在5 mmol/L EDTA下获得最高产率。缓冲液pH值为7.8。数据显示平均值±SD，n=3个独立实验。F类–我，量化心肌细胞杆状形态(F类和**H（H）**)和生存能力（排除乙炔同二聚体染色，**G公司**和我)在规定pH值范围内培养7天(F类和**G公司**)以及在最佳pH值7.4下添加或不添加脂质(**H（H）**和我)，如图所示。数据显示平均值±SD，n=2个生物三重独立实验。J型如图所示，增加培养时间后，用肌聚体-α-肌动蛋白抗体（ACTN2；绿色）和DAPI（4'，6-二氨基-2-苯基吲哚）对心肌细胞进行免疫染色和共焦成像。培养8d后观察到肉块组织丢失。从第8天开始，在培养物中加入10%的胎牛血清，并去除2,3-丁二酮一肟。延长培养时间后，肌体结构得以重建，细胞-细胞接触形成，同步自发收缩。比例尺=50μm。

**图4。培养的心肌细胞保留了转录和功能特征，可供研究。**
A类，分离的心肌细胞可以在完整的质膜下存活。新镀的心肌细胞保留钙黄绿素（绿色），但不包括乙炔（EtH，红色）。10μmol/L过氧化丁基（TBH）的加入导致钙黄绿素逃逸和EtH进入。核反染色，Hoechst-33342。比例尺=100μm。B与假手术对照组相比，从肥大的压力-过载模型（TAC）中分离出来后，两个心室的肌细胞保留特征性转录特征。通过定量聚合酶链式反应定量表达，相对于*18秒*数据显示平均值±SD，每组3只小鼠**P<0.05*, ***P<0.01*，学生t吨测试。C类，低氧调节基因*Nppa公司*,*Nppa公司*,*我的7*,*Slc2a1系列*、和*香港2号*，但不是*Mx公司*我1低氧暴露24h后，培养心肌细胞中的，均显著上调。数据显示平均值±SD，n=3个独立实验，相对于*18秒*. ***P<0.01*, ****P<0.001*，学生t吨测试。**D–H型**，肌细胞对肾上腺素能刺激具有剂量依赖性。D类Western blot，在添加去甲肾上腺素（NE）或异丙肾上腺素（ISO）20分钟后，证明AKT和磷酸化λ（PL）磷酸化，如图所示。**E–H（E–H）**如图所示，用fura2-AM加载肌细胞，并在ISO存在下以2 Hz的频率起搏。使用集成光度/收缩系统（Ionoptix）测量钙瞬变和肌节长度缩短。E类钙瞬变的代表性原始痕迹(**上面的**)和肌节长度(降低)从单个单元格记录，按指示添加ISO。钙瞬态振幅(F类)，钙瞬时衰变(**G公司**)和%肌节长度（SL）缩短(**H（H）**)随后根据ISO添加情况进行量化，如图所示。数据显示3个心脏的平均±SE，n≥9个细胞**P<0.05*，单因素方差分析，然后进行Dunnett多重比较测试。

**图5。孤立的心肌细胞显示正常的钠电流（I_纳).**
我_纳在新鲜分离的左心室心肌细胞中测量。A类，代表性电压依赖型I_纳从单个心室心肌细胞记录的原始痕迹。电压协议如插图所示。B，I的电流-电压关系的平均数据_纳电流密度（pA/pF；n＝来自3个心脏的8个细胞）。C类，显示电压依赖稳态I的代表性原始轨迹_纳灭活。电压协议如插图所示。**D、，**I的平均数据_纳失活曲线（n=8个来自3个心脏的细胞）。

**图6。来自同一小鼠心脏的心肌细胞和成纤维细胞的同时培养和研究。**
A类三维培养后，用心肌肌钙蛋白-T抗体（TNNT2，红色）、波形蛋白抗体（VIM，绿色）和DAPI（4'，6-二氨基-2-苯基吲哚）对分离的心肌细胞（CM）和心肌成纤维细胞（CF）进行免疫染色。特异性染色显示肌细胞和非肌细胞组分分离强烈。B、培养CM、尾部成纤维细胞（TF）和CF在三维培养后的转录分析，以及培养1（p1）或2（p2）代后的CF。通过定量聚合酶链反应测定选定的心肌细胞相关基因（CM）、典型成纤维细胞相关基因和心脏相关基因的表达，与*18秒*，并以热图格式显示。数据表示平均表达，n=2个独立的生物实验，一式三份。C类，来自同一小鼠心脏的心肌细胞和成纤维细胞的共培养。分离细胞组分，在三维分离培养后重组，并在10%胎牛血清中再维持4天。细胞被固定，并与抗肌动蛋白（ACTN2，绿色，CM）、波形蛋白（VIM，红色，CF）和DAPI抗体共染色。D类用10 ng/mL转化生长因子β（Tgfb）孵育24小时后，通过免疫染色检测平滑肌α-肌动蛋白（ACTA2）的产生，检测分离CFs的激活。E类，用Tgfb激活孤立CFs的可能性持续至少2代。数据显示平均值±SD，n=2个生物三重独立实验，*学报2*表达式相对于*18秒*. ***P<0.01*, ****P<0.001*，学生t吨与相关的非模拟控制进行比较。

**图7。分离的心脏非肌细胞代表异质人群。**
A类流式细胞术检测到假定身份标记物阳性的非肌细胞分数细胞的相对比例：ACTA2（平滑肌）、THY1（心脏成纤维细胞）、CD146、GSL-Isollectin-B4（内皮细胞）和CD45（免疫细胞）。3个独立实验的平均数据。B，CD31（PECAM-1）在亚融合非肌细胞部分培养物中的免疫染色显示内皮样细胞簇（绿色）。C类和D类在后共流培养中，观察到这些细胞形成CD31-阳性（绿色）、富含肌动蛋白（用荧光结合的卵磷脂染色；红色）网络(C类)其对成纤维细胞标志物波形蛋白（VIM；绿色；D类). 所有比例尺=100μm。

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中的注释

使用或不使用Langendorff：一种随时间变化的成年肌细胞分离测试新方法。
Chen X、O'Connell TD、Xiang YK。 Chen X等。 2016年9月30日Circ Res；119(8):888-90. doi:10.1161/CIRCRESAHA.116309734。 Circ Res.2016年。 PMID：27688302 免费PMC文章。没有可用的摘要。

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