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.2016年10月;17(10):1452-1470.
doi:10.15252/embr.201642051。 Epub 2016年8月5日。

一种新的小鼠双细胞胚胎卵裂所必需的长基因间非编码RNA

附属公司

一种新的小鼠双细胞胚胎卵裂所必需的长基因间非编码RNA

王家强等。 EMBO代表. 2016年10月.

摘要

内源性逆转录病毒(ERV)在卵裂期胚胎中具有转录活性,但其功能尚不清楚。ERV序列存在于小鼠和人类的大多数长基因间非编码RNA(lincRNAs)中,在许多细胞过程和疾病中起着关键作用。在这里,我们将LincGET鉴定为一种核lincRNA,它与GLN-、MERVL-和ERVK-相关,对小鼠胚胎发育到双细胞阶段之后至关重要。LincGET在晚期的二到四细胞小鼠胚胎中表达。其耗竭导致发育停滞在双细胞期的晚期G2期,并导致MAPK信号通路抑制。LincGET与hnRNP U、FUBP1和ILF2形成RNA蛋白复合物,促进GLN、MERVL和ERVK(GLKLTR)中长末端重复序列(LTR)的顺式调节活性,并抑制RNA选择性剪接,部分通过下调hnRNP U、FUBP1和ILF2蛋白水平。原核期注射Hnrnpu或Ilf2 mRNA也会降低着床前发育速度,而原核期注入Fubp1 mRNA会导致双细胞期阻滞。因此,作为第一个与ERV相关的功能性lincRNA,LincGET为ERV在卵裂期胚胎发育中的功能提供了线索。

关键词:ERV;外显子跳跃;lincRNA;转录调控;双电池组。

PubMed免责声明

数字

图EV1
图EV1。林格特代伊是ERV相关的转录本
  1. 小鼠植入前胚胎中36个新转录物的基因座(GenBank登录号见表EV2)。23个是GLN相关的,5个是MERVL相关的,4个是LINE相关的,1个位于Gm7627和NR2F2之间的基因间区域,1个在Ak045672的内含子中,1个是5′UTR相关的,并且1个是Serpinc1型.

  2. 基因座林格特代伊显示了底漆和TaqMan探针。RACE,cDNA末端快速扩增。AATAAA是聚腺苷酸信号位点。

图1
图1。林格特代伊是二至四细胞胚胎特异性ERV相关核lincRNA
  1. 基因座林肯代伊.林格特介于达尔克1b通用18672,Dyei介于达尔克1b开斋节2之间有一个GLN序列和一些MERVK或MERVL的ERV片段达尔克1b通用18672AATAAA是聚腺苷酸信号位点。

  2. 单链RT-PCR(SSRT-PCR)结果林格特.林格特是从最上面的一股转录而来的。链特异性逆转录中使用的引物以绿色显示,而PCR中使用的底物以红色显示。每个实验使用了大约50个早期四细胞胚胎,并进行了三次实验复制。

  3. 3′RACE和5′RACE结果林格特代伊基因特异性引物(F4、F5、R4和R5)如图EV1B所示*指示与正确的3′RACE频带相对应的频带林格特每个RACE实验使用了大约200个早期四细胞胚胎,并进行了三次重复实验。

  4. 亚细胞定位分析林格特代伊通过RNA分馏和TM-qPCR分析。结果表明:林格特戴伊位于细胞核内,主要与染色质结合。误差条代表s.e.m.Chro,染色体;Nuc,核质;细胞,细胞质。Gapdh公司西斯特分别作为细胞和色度控制。每个实验使用了大约500个早期四细胞胚胎,并进行了三次重复实验。

  5. miRNA反向Northern印迹林格特戴伊加入双适配体后,通过RT-PCR分离和扩增miRNA;然后进行Southern blot(反向Northern)。它没有显示小RNA产物的证据,表明林格特代伊miR1982用作miRNA阳性对照。每个实验使用了大约400个早期四细胞胚胎,并进行了三次重复实验。

  6. 的表达式模式林格特代伊通过TM‐qPCR在植入前小鼠胚胎的不同阶段进行检测。误差条代表s.e.m。每个阶段使用了大约50个胚胎,并进行了三次重复实验。

  7. RNA‐FISH在早期2至16细胞胚胎中的表达林格特代伊结果表明:林格特存在于晚期二至四细胞胚胎的细胞核中,在早期八细胞胚胎中弱表达,而代伊存在于两到四个细胞胚胎的细胞核中。E2C,早期双细胞阶段(n个=每个探头6个);L2C,晚期双细胞期(n个=每个探头7);E4C,早期四细胞期(n个=每个探头6个);L4C,晚期四细胞期(n个=每个探头5个);E8C,早期八细胞阶段(n个=每个探头4个);L8C,晚期八细胞期(n个=每个探头5个);16C,16电池级(n个=每个探头4个);BL,胚泡(n个=每个探针5)。比例尺,50μm。进行了三次实验重复。

图EV2
图EV2。林格特耗竭导致双细胞期G2晚期发育停滞,而代伊耗尽对植入前发育没有影响
  1. A类

    siRNA或dsRNA不能有效干扰核林格特代伊在phCG 25 h注射siRNA或dsRNA,在双细胞晚期phCG 48 h收集胚胎进行TM-qPCR分析。误差条代表s.e.m。进行了三次重复实验,每次使用约50个胚胎。

  2. B类

    代伊‐LNA可有效耗尽核能代伊在phCG下注射LNA 25 h,在双细胞晚期phCG 48 h收集胚胎进行TM-qPCR分析。误差条代表s.e.m。进行了三次重复实验,每次使用约50个胚胎。

  3. C–E类

    林肯耗竭导致双细胞期晚期G2期发育停滞,并共同注入全长的林肯GET1缺乏林格特‐LNA2靶位点,但部分序列的靶位点不能部分挽救胚胎发育。代伊耗尽对植入前发育没有影响。2C,双细胞期;4–8C,四至八细胞阶段;BL,胚泡期;6248号,全长LincGET公司1例LNA靶点突变;2900个,1–2900吨林肯GET1LNA靶点突变;2620–6248,2620–6.248吨林格特1.高,400纳克/μl;低,150纳克/微升。同一面板中的不同字母表示显著差异(P(P)< 0.001).

  4. F类

    注入代伊‐LNA对植入前发育无显著影响。在phCG注射LNA 25小时,并在胚泡晚期的phCG 114小时拍摄照片。比例尺,50μm。

图2
图2。林格特耗竭导致双细胞期G2晚期发育停滞,对ZGA的启动和着丝粒周围环的重组没有影响
  1. 分析影响的实验方案林格特胚胎发育耗竭。phCG,人绒毛膜促性腺激素后注射;LNA,锁定核酸;IF,免疫荧光。在phCG 25 h注射LNA。对于BrdU染色,在phCG30 h添加BrdU。对于EU染色,在phCG 40 h添加EU。在phCG48 h进行IF,包括检测BrdU和EU。

  2. LNA有效介导林肯击倒。在phCG下注射LNA 25 h,在双细胞晚期的phCG条件下48 h收集胚胎进行TM-qPCR分析。误差条代表s.e.m。每个阶段使用了大约50个胚胎,并进行了三次重复实验。

  3. 林格特耗尽的胚胎在双细胞期停滞。在phCG注射LNA 25小时,并在胚泡晚期的phCG 114小时拍摄照片。注射对照-LNA的胚胎可以发育到囊胚晚期,而林格特耗尽的胚胎在双细胞期停滞。比例尺,100μm。每次LNA注射至少进行三次实验重复(表1)。

  4. 林格特耗尽导致双细胞期G2期发育停滞,而不影响DNA完整性和复制。我们使用BrdU可视化S和G2相,使用CAF‐1可视化S相,使用PI可视化M相。细胞周期蛋白B1是G2期和H2A的标志物。X是DNA损伤的标记。Aphidicolin处理的胚胎在没有DNA复制的情况下停滞在S期。在phCG 25 h注射LNA,在phCG48 h收集双细胞晚期胚胎进行IF分析。比例尺,50μm。进行了三次实验重复,每组使用约15个胚胎。

  5. EU染色显示正常的主要ZGA过程林格特消耗。将EU添加到phCG 40 h的培养基中,并在phCG 48 h检测EU信号。标尺,50μm。进行了三次重复实验,每组使用了大约15个胚胎。

  6. 与主要ZGA启动相关的基因,如Hsc70型,热休克蛋白70,Erv4、Eif1a、和Zscan4公司,通常表示为林格特与对照胚胎相比,缺乏L2C胚胎。在双细胞晚期的phCG 48 h收集注射LNA的胚胎,用于TM-qPCR分析。误差条代表s.e.m。每组使用了大约100个胚胎,并进行了三次重复实验。不另说明。,P(P)> 0.05.

  7. 之后,近心卫星的转录正常林格特消耗。在双细胞晚期的phCG 50 h时收集注射LNA的胚胎,以进行TM‐qPCR分析。误差条代表s.e.m。每组使用约50个胚胎,进行三次重复实验。未另行规定。,P(P)> 0.05.

  8. 对主要转录物的DNA‐FISH分析表明,向色心的中心周围结构域重组不受林格特消耗。比例尺,50μm。进行了三次重复实验,每组使用了大约15个胚胎。

图EV3
图EV3。林格特耗竭导致双细胞期G2晚期发育停滞,对ZGA的启动和着丝粒周围环的重组没有影响
  1. 林格特耗尽导致双细胞期G2期发育停滞,而不影响DNA完整性和复制。我们使用BrdU可视化S和G2相,使用CAF‐1可视化S相,使用PI可视化M相。细胞周期蛋白B1和组蛋白H3丝氨酸10磷酸化(H3S10ph)是G2期和H2A期的标志物。X是DNA损伤的标记。Aphidicolin处理的胚胎在没有DNA复制的情况下停滞在S期。在phCG下注射LNA 25 h,在双细胞晚期phCG 48 h收集胚胎进行IF分析。比例尺,50μm。进行了三次重复实验,每组使用了大约15个胚胎。

  2. 胚胎注射LincGET公司‐LNA在G2期被阻止,未观察到DNA复制。结果表明,注射对照-LNA的胚胎为BrdU阳性并达到四细胞期,而注射林格特‐LNA为BrdU阴性,在双细胞期被抑制。在晚期双细胞期(phCG 48 h)添加BrdU,并在晚期四细胞期(phCG 62 h)测量。比例尺,50μm。进行了三次重复实验,每组使用了大约15个胚胎。

  3. EU染色显示术后正常的主要ZGA过程林格特消耗。将EU添加到phCG 40 h的培养基中,并在phCG 48 h检测EU信号。标尺,50μm。进行了三次重复实验,每组使用了大约15个胚胎。

  4. 对主要转录物的DNA‐FISH分析表明,向色心的中心周围结构域重组不受林肯消耗。比例尺,50μm。进行了三次重复实验,每组使用了大约15个胚胎。

图3
图3。林格特耗竭导致MAPK信号通路受到抑制
  1. 基于RNA-seq数据的差异表达基因(DEGs)分析。与对照组相比,LNA L2C中723个基因上调,521个基因下调林格特耗尽的胚胎。

  2. DEGs的KEGG通路分析表明,MAPK信号通路主要受以下因素的影响林格特消耗。

  3. ERK1/2-MAPK或LNK/P38-MAPK信号通路中关键因子的表达受以下因素的显著影响林格特消耗。在两细胞晚期的phCG 48小时收集注射LNA的胚胎,用于SG‐qPCR分析。误差条代表s.e.m。每组使用了大约150个胚胎,并进行了三次重复实验。双尾学生试验用于统计分析。

  4. Western blot分析表明,MAPK信号通路中关键激酶p38和ERK1/2的蛋白和磷酸化水平在林格特耗尽2C。在phCG下48小时,在双细胞后期收集注射LNA的胚胎进行Western blot分析,每个通道使用约200个胚胎。进行了三次重复实验。

  5. 免疫荧光显示P38和ERK1/2的磷酸化水平在林格特耗尽2C。在双细胞晚期48小时phCG时采集注射LNA的胚胎进行IF分析。比例尺,50μm。进行了三次重复实验,每组使用了大约15个胚胎。

  6. 荧光强度的量化表明,P38和ERK1/2的磷酸化水平在林格特耗尽2C。双尾学生试验用于统计分析。误差条代表s.e.m。进行了三次实验重复,每组使用约15个胚胎。P(P)控制LNA组和林格特显示LNA组。两者之间没有区别林格特‐LNA1和林格特‐LNA2.与面板(E)和附录图S4B相关。

  7. ERK1/2‐MAPK或LNK/P38‐MAPK信号通路的一些靶基因的表达受到LincGET公司消耗。在双细胞晚期48小时phCG下收集注射LNA的胚胎,用于SG‐qPCR分析。误差条代表s.e.m。每组使用了大约150个胚胎,并进行了三次重复实验。双尾学生试验用于统计分析。

图4
图4。林格特绑定到hnRNP U、FUBP1和ILF2
  1. 林格特与hnRNP U、FUBP1和ILF2相互作用体外RNA下拉分析后SDS-PAGE凝胶的银染色显示,蛋白质与林格特(右车道)和反义林格特‐LincGET公司,中间车道)。仅对6367个早期四细胞胚胎进行了一次下拉式质谱分析。通过质谱分析右通道(箭头)中的三个特定带,确认为hnRNP U、FUBP1和ILF2。

  2. hnRNP U和ILF2的质谱结果在RNA下拉分析(下拉WB)后通过Western blot证实;α‐,反‐。对于每个下拉WB分析,使用了大约1500个早期四细胞胚胎,并进行了三次重复实验。

  3. 的表达式模式Srsf1型用SG‐qPCR测定植入前小鼠胚胎。1C,合子期;2C,双细胞期;4C,四细胞期;8C,八细胞期;16C,16细胞期;32C,32细胞期;BL,囊胚期。误差条代表s.e.m。每个阶段使用大约50个胚胎,并进行了三次实验重复。

  4. Co-IP导致使用抗-SRSF1的早期四细胞胚胎和使用抗-SRSAF1或抗-HA(针对HA标记的MS2外壳蛋白)的小鼠ESC。结果表明:LincGET公司与hnRNP U、FUBP1、ILF2和SRSF1形成RNA-蛋白质复合物。此外,hnRNP U、FUBP1、ILF2和SRSF1可以在没有林格特对于每个co-IP分析,大约2500个早期四细胞胚胎或1×106使用小鼠ESCs,进行三次重复实验。E4C,早期四细胞胚胎;mES、小鼠ESCs;林格特‐,林格特消除;林格特+,林格特过度表达。

  5. 模型显示林格特作为转录因子和RNA选择性剪接因子,通过与hnRNP U、FUBP1和ILF2结合。

图5
图5。林格特兼作转录因子和外显子跳跃剪接抑制剂
  1. DEGs到相邻GLKLTRs的中间距离(红色箭头)和随机基因的分布(蓝色)(P(P)< 2.2 × 10−16)采用Wilcoxon秩单检验进行测量。GLKLTR是包含GLN、MERVL或ERVK的完整LTR的基因座。结果表明,二甘醇优先于GLKLTR。

  2. Dox诱导林格特表达分析和双荧光素酶报告系统表明林格特以剂量依赖性方式增加293T细胞中GLKLTRs的增强子活性。GLKLTRs的增强子活性也因hnRNP U或ILF2的过度表达而增加,而因FUBP1的过表达而降低,这对林格特水平。这个轴显示了荧光素酶报告质粒和过表达基因的构建。进行了三次重复实验。双尾学生试验用于统计分析。不同的字母表示显著差异(P(P)< 0.01).

  3. 异常选择性剪接基因(UASGs,FDR<0.05)的数量和百分比林格特相较于控制‐LNA L2C,耗尽2C。ExS,外显子跳跃;A5S,可供选择的5′剪接;InR,内含子保留。

  4. 对UASG的GO‐BP分析表明,“细胞周期”尤其是“有丝分裂细胞周期的M期”主要受到影响。与的条款P(P)显示<0.001和FDR<1。

  5. 镉钾1外显子跳跃剪接林格特耗尽2C,导致Cdk1‐3ExS公司其中第三个外显子被删除。异常拼接Cdk1‐3ExS公司变量转换为截断变量CDK1型缺乏N末端70氨基酸(aa),从而影响CDK1型缺乏InterPro预测的保守ATP结合域。面板PCR引物(F)(镉钾1‐Ex3‐F和镉钾1‐Ex3‐R,序列如表EV1所示)用红色三角形表示。

  6. 外显子跳跃事件Cdk1‐3ExS公司在里面林格特RT–PCR证实2C耗尽。注入林格特原核期的片段不能抑制Cdk1型,同时注入全长LincGET公司缺少1个林格特‐LNA2靶位点部分抑制了镉钾1每个通道使用了大约50个胚胎。误差条代表s.e.m。进行了三次重复实验。双尾学生试验用于统计分析。

图EV4
图EV4。DEG和拼接事件的一些特征林格特耗尽2C
  1. DEG和GLKLTR的位置。红线代表上调基因;蓝线代表下调基因;绿色斑点代表GLKLTR。

  2. 观察到三种类型的选择性剪接事件,并且对照组-LNA L2C和林格特耗尽2C。

  3. CDK1型InterPro预测蛋白质结构域(http://www.ebi.ac.uk/interpro/). ATP结合结构域位于N-末端。

  4. 中跳过外显子的预测基序林格特耗尽2C。我们分析了林格特带有侧翼200 bp内含子序列的耗尽2C,以及相对于随机控制外显子在这些跳跃外显子中富集的12个基序(P(P)< 10−10)检测到。这12个图案中的8个(左)属于林肯.另一个4林格特,它们不是结合基序(右,UGUGUG基序),是Dmd内含子38(UUGUUGU)中的FUBP1靶向序列,是外显子39跳过剪接所必需的。

图6
图6。林肯降低hnRNP U、FUBP1和ILF2蛋白水平
  1. 正常L2C、E4C和注射对照-LNA的胚胎中hnRNP U、FUBP1、ILF2和SRSF1的IF染色林格特-LNA公司。结果表明,hnRNP U、FUBP1、ILF2和SRSF1存在于2至4细胞胚胎的细胞核中,并且在胚胎发育结束后,hnRNP-U、FUBP1和ILF2的表达显著增加林格特消耗。分别在phCG 48 h和54 h采集正常L2C和四细胞胚胎。在phCG 48 h下收集注射LNA的胚胎。比例尺为50μm。进行了三次重复实验,每组使用了大约15个胚胎。

  2. 荧光强度的量化显示,hnRNP U、FUBP1和ILF2的表达在林格特消耗。双尾学生试验用于统计分析。误差条代表s.e.m。进行了三次重复实验,每组使用了大约15个胚胎。与面板(A)和附录图S5相关。不另说明。,P(P)> 0.05.

  3. 林格特胚胎中的缺失对Hnrnpu公司,Fubp1功能,Ilf2型、和Srsf1系列通过SG‐qPCR测量。进行了三次重复实验,每次使用约50个胚胎。双尾学生试验用于统计分析。不另说明。,P(P)>0.05之间。误差条代表s.e.m。

  4. LincGET公司通过Western blot,小鼠ESCs中的过度表达降低了hnRNP U、FUBP1和ILF2的蛋白水平。进行了三个实验重复,约1×106每次使用细胞。

  5. 林格特小鼠ESCs的过度表达对Hnrnpu公司,Fubp1型,Ilf2型、和Srsf1系列通过SG‐qPCR测量。进行了三个实验重复,约1×106每次使用细胞。双尾学生‐测试用于统计分析;不另说明。,P(P)> 0.05. 误差条代表s.e.m。

图7
图7。hnRNP U、FUBP1和ILF2促进镉钾1
  1. A类

    RT-PCR结果显示,hnRNP U、FUBP1和ILF2促进了细胞外显子3的跳跃镉钾1.我们注入了控制‐LNA或林肯‐LNA2和siRNAEgfp公司,Hnrnpu公司,Fubp1功能,或Ilf2型或对照‐LNA和其中一个在原核期的mRNA(12组),并进行评估镉钾1Cdk1‐3ExS公司两细胞晚期的水平(phCG 48小时)。每条车道使用了大约50个胚胎。进行了三次重复实验。结果表明,击倒Hnrnpu公司,Fubp1功能,或Ilf2,但不是Egfp公司在…面前林格特对外显子3的跳过没有影响镉钾1(左4车道)。击倒任何一方Hnrnpu公司,Fubp1功能,或Ilf2,但不是Egfp公司在没有林格特减少了Cdk1‐3ExS公司水平(中间4车道),尤其是si‐Fubp1功能.过度表达Hnrnpu公司,Fubp1功能,或Ilf2,但不是Egfp公司在…面前林格特促进第3外显子跳跃Cdk1型(右4车道),尤其是Fubp1功能.对条带强度进行了量化,并在凝胶图像下显示。双尾学生测试用于统计分析,不同字母表示显著差异(P(P)< 0.05). si‐,siRNA;OE‐,过度表达。误差条代表s.e.m。

  2. B类

    击倒任何一方Hnrnpu公司,Fubp1功能,或Ilf2型在…面前林格特对植入前发育无影响。我们注射对照-LNA和siRNAEgfp公司,Hnrnpu公司,Fubp1功能,或Ilf2型在原核期,在二细胞(2C)、四细胞(4C)、八细胞(8C)、桑椹胚(M)和囊胚(BL)期评估发育情况。进行了三次重复实验(表1)。双尾学生试验用于统计分析。si‐,siRNA。误差条代表s.e.m。

  3. C类

    Fubp1功能击倒可以部分挽救因以下原因导致的2C被捕林格特胚泡期的耗竭,以及Ilf2型击倒可以提高4C的发育速度,但Hnrnpu公司击倒并不能促进发展。我们注射了林格特‐LNA2和siRNAEgfp公司,Hnrnpu公司,Fubp1功能,或Ilf2型在原核期,在2C、4C、8C、M和BL期评估发育情况。进行了三次重复实验(表1)。双尾学生试验用于统计分析*P(P)<0.05,以及**P(P)<0.01。LNA2、,林格特‐LNA2.si‐,siRNA。误差条代表s.e.m。

  4. D、 E类

    Fubp1功能在存在林格特导致2C被捕,以及Hnrnpu公司Ilf2型过度表达可降低植入前发育率。我们注射对照-LNA和mRNAEgfp公司,Hnrnpu公司,Fubp1型,或Ilf2型在原核期,在2C、4C、8C、M和BL期评估发育情况。图像采集于BL期(E)。进行了三次重复实验(表1)。双尾学生试验用于统计分析*P(P)<0.05,以及**P(P)<0.01。OE‐,过度表达。误差条表示s.e.m.(D)。比例尺,100μm(E)。

图EV5
图EV5。模型表示林格特功能
在正常的双细胞小鼠胚胎中,林肯作为转录因子,介导顺式GLKLTRs的调节活性和外显子跳跃抑制剂,部分通过降低hnRNP U、FUBP1和ILF2蛋白水平(up)实现。然而,当林格特缺失、无序转录和无序RNA剪接将导致一些M期相关基因的ZGA、MAPK信号抑制和外显子跳跃紊乱,包括镉钾1,导致G2/M块(向下)。

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引用人

工具书类

    1. Probst AV,Almouzni G(2011)《全基因组表观遗传重编程背景下异染色质的建立》。趋势基因27:177-185-公共医学
    1. Schultz RM(2002)着床前胚胎母体到合子转变的分子基础。Hum Reprod更新8:323–331-公共医学
    1. Bedzhov I、Graham SJ、Leung CY、Zernicka‐Goetz M(2014)《小鼠早期胚胎的发育可塑性、细胞命运规范和形态发生》。Philos Trans R Soc Lond B生物科学369:20130538-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Macfarlan TS、Gifford WD、Driscoll S、Lettieri K、Rowe HM、Bonanomi D、Firth A、Singer O、Trono D、Pfaff SL(2012)胚胎干细胞效力随内源性逆转录病毒活性波动。自然487:57–63-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Kapusta A、Kronenberg Z、Lynch VJ、Zhuo X、Ramsay L、Bourque G、Yandell M、Feschotte C(2013)转座因子是脊椎动物长非编码RNA起源、多样化和调控的主要因素。公共科学图书馆-基因9:e1003470-项目管理咨询公司-公共医学

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