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.2016年8月1日；9(8):885-97.
doi:10.1242/dmm.024851。 Epub 2016年6月9日。

核结构改变促进小鼠狼疮自身免疫

纳姆拉塔·辛格 1, 邓肯·B·约翰斯通 2, 凯拉·A·马丁 三, 意大利蛋彩画 三, 玛丽安娜·J·卡普兰 4, 迈克尔·F·丹尼 5
附属公司

核结构改变促进小鼠狼疮自身免疫

纳姆拉塔·辛格等。 Dis模型机械. .

摘要

系统性红斑狼疮（SLE）是一种自身免疫性疾病，其特征是产生识别细胞核成分的自身抗体。绝大多数狼疮研究都集中在免疫细胞功能障碍或疾病的遗传学方面。因为从人类SLE患者分离的粒细胞的中性粒细胞核形态发生了类似于Pelger-Huet异常的改变，并且编码核膜蛋白层粘连B受体（LBR）的mRNA出现了明显的错误拼接，这与他们的Pelger-Huet样核形态一致，我们使用一种新型的小鼠模型系统来验证这样的假设，即细胞核本身结构的破坏也有助于狼疮自身免疫的发展。将狼疮易感小鼠品系新西兰白（NZW）与Lbr（B6.Lbr（ic/+））中含有杂合常染色体显性突变的c57Bl/6小鼠杂交，并评估（NZW×B6.Lbr（ic））F1后代是否诱导狼疮自身免疫。只有雌性（NZW×B6.Lbr（ic））F1小鼠产生狼疮自身免疫，包括脾肿大、肾损伤和自身抗体。肾脏损伤伴有免疫复合物沉积，以及单核细胞的血管周围和小管浸润。抗染色质抗体的滴度超过了老龄雌性MRL-Fas（lpr）小鼠的滴度，并且主要是IgG2亚类。雌性（NZW×B6.Lbr（ic））F1血清的抗核抗体染色图谱复杂，包括与A型膜共定位的抗核膜反应性，以及与组蛋白识别相关的同质模式，共价修饰与基因激活相关。还鉴定出一种识别钙网蛋白的抗中性粒细胞IgM，但不识别髓过氧化物酶（MPO）或蛋白酶3（PR3）。因此，当在狼疮易感遗传背景下表达时，核结构的改变有助于狼疮自身免疫，这表明核结构的破坏是遗传易感个体狼疮自身免疫力发展的机制。

关键词：自身抗体；钙网蛋白；染色质；组蛋白修饰；叶片；核心。

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数字

图1。
图1。
SLE患者PMN中LBR剪接缺陷。（A） 健康人分离的正常密度中性粒细胞和两名SLE患者的LDG的差异染色显示了SLE中性粒细胞的Pelger–Huet样核形态。图像放大，400×。（B） PCR扩增从对照PMN、SLE正常密度PMN和LDG制备的人类LBR cDNA的外显子7至14。样本车道上方的水平线反映平行隔离的LDG和正常密度PMN的自体对。箭头指示正确拼接的人类LBR的位置。（C）人类LBR cDNA扩增子的亚克隆和测序证实了mRNA的错误拼接，并确定了LBR第10外显子的广泛跳跃，无论是单独还是与第9外显子和/或第12外显子结合。通过Fisher精确检验（单尾）评估统计显著性。
图2。
图2。
女性（NZW×B6.Lbr）脾肿大和肾脏损害的发展集成电路)F类1老鼠。（A） 从四只雌性（NZW×B6.Lbr）分离出完整的脾脏集成电路)F类1小鼠和一只雌性（NZW×B6）F1控件。三只雌性（NZW×B6.Lbr）的脾脏集成电路)F类1小鼠变大了，而第四只的大小与对照组相似。（B） 平均体重(年-轴）和脾肿块(x个-轴）在NZW×B6（填充符号）和NZW x B6.Lbr雄性（三角形）和雌性（圆形）小鼠中集成电路（开放符号）基因型。误差条代表s.e.m.星号（*）表示雌性小鼠脾脏重量的显著差异（NZW×B6.Lbr集成电路)F类1小鼠相对于雌性（NZW×B6）F1室友（学生的t吨-测试，双尾，P（P）<0.05). （C） 代表女性（NZW×B6.Lbr）的Masson’s Trichrome染色肾脏切片集成电路)F类1肾损伤和血管周围细胞浸润最严重的小鼠。图像放大，200×。（D） 马森氏染色切片对肾脏损伤的组织学评价。内螺纹（NZW×B6）F1（实心圆）和（NZW×B6.Lbr集成电路)F类1（开环）评估肾小管间质纤维化(年-轴）和肾小球硬化(x个-轴）。红色符号表示相应组的平均值和标准偏差。星号（*）表示肾小球硬化显著差异，匕首（†）表示肾小管间质纤维化显著差异，Mann-Whitney检验，单侧。（E） 马尾松毛染色切片细胞浸润的组织学评价。内螺纹（NZW×B6）F1（实心圆）和（NZW×B6.Lbr集成电路)F类1（开环）评估小管白细胞浸润(年-轴）和间质浸润(x个-轴）。红色符号表示相应组的平均值和标准偏差。星号（*）表示间质白细胞数存在显著差异，匕首（†）表示小管白细胞数有显著差异，Student’st吨-测试，单尾。（F） 女性肾小球中的免疫复合物沉积（NZW×B6.Lbr集成电路)F类1老鼠。冷冻肾切片用Cy3-结合羊抗鼠IgG染色以检测肾小球IgG的存在，细胞核用DAPI反染。雌性（NZW×B6）F肾脏切片的相应染色1鼠标显示在图S1.图像放大倍数，400倍。
图3。
图3。
女性狼疮自身抗体（NZW×B6.Lbr）的发展集成电路)F类1老鼠。（A，B）（NZW×B6.Lbr）中性粒细胞核形态的破坏集成电路)F类1老鼠。从女性（A）和男性（B）分离的白细胞（NZW×B6.Lbr集成电路)F类1和（NZW×B6）F1小鼠用FITC-偶联抗Ly-6G染色以鉴定中性粒细胞，细胞核用DAPI反染。（NZW×B6）F的环状核形态1小鼠具有小鼠中性粒细胞的特征，而（NZW×B6.Lbr）的核形态紊乱集成电路)F类1中性粒细胞与常染色体显性断裂相一致液化石油气（C）雌性（NZW×B6）F血清的抗色素酶联免疫吸附试验1（实心圆圈）和（NZW×B6.Lbr集成电路)F类1老鼠（开圆圈）。最初对血清进行抗染色质IgG滴度相对于女性MRL-Fas的筛选lpr公司.（D）来自六个抗染色质IgG阳性（NZW×B6.Lbr）的血清集成电路)F类1小鼠和一个抗染色质阴性（NZW×B6）F1随后对小鼠进行IgG抗染色质滴度筛选1，IgG2a个，IgG2亿，IgG2厘米和相对于女性MRL-Fas的IgMlpr公司（E）HEp-2细胞系与女性血清（NZW×B6.Lbr）的特异性抗核抗体（ANA）染色模式集成电路)F类1（左侧面板）和MRL-Faslpr公司鼠标（右侧面板）。女性的附加图像（NZW×B6.Lbr集成电路)F类1小鼠和雌性（NZW×B6）F1显示在中图S2雄性小鼠的抗核抗体染色见图S3.图像放大倍数，1000×。
图4。
图4。
内螺纹（NZW×B6.Lbr集成电路)F类1小鼠产生识别与基因激活相关的组蛋白H3修饰的抗核自身抗体。（A） 抗核反应的协同放大和活化相关组蛋白H3修饰H3K4me3（左面板）、H3K27ac（中面板）和H3K9ac（右面板）。雌性（NZW×B6.Lbr）抗核抗体（ANA）染色集成电路)F类1血清用Alexa Fluor 488-结合的山羊抗鼠抗体检测，抗修饰的H3组蛋白用Alexa-Fluor 594-结合的山羊-兔二级抗体检测。用DAPI对细胞核进行复染。图像放大1000倍。单个的红色、绿色和蓝色通道显示了抗核自身抗体反应的同质组分与修饰组蛋白的共同定位图S4（B）A.（NZW×B6.Lbr）介导的反核染色显示单个细胞的数字放大集成电路)F类1绿色通道中显示血清，红色通道中显示修饰组蛋白。黄色重叠信号表示小鼠血清免疫反应与抗修饰H3组蛋白的核共定位。（C） 从HeLa细胞纯化的组蛋白被生物素化在体外，免疫沉淀（NZW×B6.Lbr集成电路)F类1小鼠血清，收集在蛋白A/G琼脂糖珠上，清洗并洗脱。回收组蛋白提取物的含量，由（NZW×B6.Lbr）特异识别的组蛋白组成集成电路)F类1用识别H3K4me3、H3K27ac、H3K9ac、H3K4me、H3K 27me3、h3K 9me3的兔血清重新沉淀小鼠血清。使用过氧化物酶结合链霉亲和素和增强化学发光对从再沉淀过程之前、期间和之后的每个步骤中收集的组蛋白提取物制备的样品进行印迹。（D） 从1×10制备的细胞质和细胞核提取物6用12%的SDS-PAGE凝胶溶解B6小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），并用两名雌性（NZW×B6.Lbr）的血清进行免疫印迹集成电路)F类1小鼠和来自老年女性MRL-Fas的混合血清lpr公司老鼠。代表性雌性（NZW×B6）F的血清染色1小鼠，以及细胞质和细胞核分馏的验证，见图S5.（E）染色质（5 µg）从雌性野生型B6和B6的肝脏中分离得到。Lbr集成电路/+小鼠，用两只雌性（NZW×B6.Lbr）的血清进行免疫印迹集成电路)F类1老鼠。
图5。
图5。
内螺纹（NZW×B6.Lbr集成电路)F类1小鼠产生识别A型叶片的抗核自身抗体。（A） HEp-2细胞与雌性（NZW×B6.Lbr）的共培养集成电路)F类1血清和层粘连蛋白A/C（左面板）、LBR（中面板）和层粘着蛋白B1（右面板）。血清中的抗核抗体（ANA）染色用Alexa Fluor 488结合的山羊抗鼠抗体检测，叶片蛋白用指示的兔抗血清和Alexa Fluor 594结合的山羊抗兔二级抗体标记。用DAPI对细胞核进行复染。图像放大1000倍。单个红色、绿色和蓝色通道显示了抗核自身抗体反应的核膜成分与A型膜的共定位图S6（B）A中指示的单个细胞的指状放大。由（NZW×B6.Lbr介导的抗核抗体染色集成电路)F类1血清显示在绿色通道中，核膜蛋白显示在红色通道中。小鼠血清与抗层粘连蛋白A/C的核膜共定位用黄色重叠信号表示。（C） 5×10的层蛋白A/C免疫印迹6用小鼠层粘连蛋白a/C单克隆抗体免疫沉淀MEFs，两名女性（NZW×B6.Lbr）的血清集成电路)F类1小鼠（血清1和2）或合并的老龄雌性MRL-Faslpr公司血清。非特异性小鼠IgG（mIgG）用作血清对照。（D） 从1×10制备的细胞质和细胞核提取物6MEF在7.5%SDS-PAGE凝胶上溶解，并用两名女性（NZW×B6.Lbr）的血清进行免疫印迹集成电路)F类1老鼠。
图6。
图6。
抗中性粒细胞血清反应性在（NZW×B6.Lbr集成电路)F类1老鼠。（A） 用DAPI染色的乙醇固定人类PMN（顶面板）和雌性PMN（NZW×B6.Lbr）的荧光显微镜集成电路)F类1小鼠血清和Alexa Fluor 488-共轭山羊抗鼠二级抗体（底部面板）。虚线圆圈表示DAPI阳性双叶嗜酸性粒细胞，女性不易检测到（NZW×B6.Lbr集成电路)F类1小鼠血清。图像放大100倍。（B） 高倍放大乙醇固定PMN染色。中性粒细胞表现出强烈的核染色，而嗜酸性粒细胞的核周染色相对较弱且呈斑片状。图像放大，400×。分离的中性粒细胞相对于外周血单核细胞和分离的单核细胞的优先染色在图S7（C）乙醇固定PMN与雌性（NZW×B6.Lbr）共染色集成电路)F类1小鼠血清（绿色）和抗MPO（红色），细胞核用DAPI（蓝色）复染。小鼠血清染色未与MPO共定位。图像放大倍数，1000倍。
图7。
图7。
抗钙调素IgM介导（NZW×B6.Lbr）的抗中性粒细胞反应性集成电路)F类1老鼠。（A） 人类PMN的Triton X-100可溶性提取物在10%SDS-PAGE凝胶上溶解，并与雌性（NZW×B6.Lbr）进行免疫印迹集成电路)F类1小鼠血清。（B） Trim21和钙网蛋白的免疫沉淀由20×10制备6人PMN，在10%SDS-PAGE凝胶上溶解，血清免疫印迹，并用识别IgG（H+L）（左侧）或IgM（右侧）的过氧化物酶偶联山羊抗鼠二级抗体检测。IgM信号形成的暴露时间是IgG（H+L）的约1/10。对照印迹（最右边的面板）证实免疫沉淀物中Trim21和钙网蛋白的恢复。（C） 从牛肝中纯化的钙网蛋白进行血清免疫印迹，并用识别IgA（左面板）、IgG（中面板）或IgM（右面板）的过氧化物酶偶联山羊抗鼠二级抗体进行检测。使用钙网织蛋白单克隆抗体的钙网织蛋白标准免疫印迹的位置由箭头指示。（D） 女性个体（NZW×B6.Lbr）IgG（H+L）（左侧）和IgM（右侧）抗钙网蛋白ELISA检测集成电路)F类1或MRL-Faslpr公司小鼠血清。虚线表示平均值加上2个标准偏差n个=7只野生型B6小鼠。（E） 对甲醛固定的PMN与雌性（NZW×B6.Lbr）共同染色集成电路)F类1小鼠血清（绿色）和兔抗钙网蛋白（红色），细胞核用DAPI（蓝色）复染。使用抗IgM二级抗体（合并：黄色信号）检测小鼠血清染色和钙网蛋白的共同定位。图像放大，400×。（F） 对甲醛固定的PMN与雌性（NZW×B6.Lbr）共同染色集成电路)F类1小鼠血清（绿色）和兔抗钙网蛋白（红色），细胞核用DAPI（蓝色）复染。抗IgG（顶面板）和抗IgA（底面板）二级抗体均未与钙网蛋白共同定位小鼠血清染色。图像放大，400×。
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