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.2015年10月；10(1):461-478.
doi:10.1515/biol-2015-0048。 Epub 2015年10月19日。

肉豆蔻酰化p110α因发育和血管缺陷导致胚胎死亡

Mee Rie Sheen先生 1, 桑德拉·华纳 2, 詹妮弗·菲尔兹 2, 何塞·R·科内乔-加西亚 三, 史蒂文·费林 4
附属公司

肉豆蔻酰化p110α因发育和血管缺陷导致胚胎死亡

Mee Rie Sheen先生等。 开放式生命科学. 2015年10月.

摘要

磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信号通路调节许多重要的细胞功能。放松管制的功能影响PIK3CA公司编码PI3K的p110α催化亚单位的基因，在一系列人类癌症中通过频繁的功能获得突变得到验证。我们生成了一个具有可诱导组成型活性形式PI3K的小鼠模型。在这个模型中，Cre重组酶激活肉豆蔻酰化形式的第110页α（myr）-第110页α). 肉豆蔻酰化版本的p110α将蛋白质带到细胞膜的细胞质侧，这模拟了p110α催化亚基的正常激活机制，并激活了PI3K酶。myr-p110α在发育中小鼠的所有细胞中诱导的成分激活的PI3K信号在胚胎发育期间导致死亡。转基因Cre；千里拉-第110页α杂合胚胎形态畸形，血管发育不良，血管极度扩张，胚胎和胚外卵黄囊出血。以前的研究表明第110页胚胎发育过程中的α会导致血管生成中断，这里我们表明，在发育过程中通过功能获得突变对p110α的结构性激活也会以类似的方式破坏血管生成/血管生成。这些发现证明严格监管的重要性胚胎期PI3K信号转导血管生成/血管生成。。

关键词：Cre重组酶；PIK3CA；血管生成；胚胎发育；出血；致命性；形态畸形；肉豆蔻酰化；p110α；血管生成。

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数字

图1
图1。Cre-inducible的生成罗莎26-千里拉-p110α敲入等位基因
（A） 克隆到pRosa26靶向载体的表达结构示意图罗莎26带有限制性位点的位点、产生的靶向位点和myr-第110页C介导切除后的α等位基因。用于PCR基因分型的标记引物用蓝色箭头指示。用于Southern blot分析的探针在罗莎26轨迹。（B） PCR检测野生型（WT）带602 bp和整合构建带314 bp的代表性结果。（C） 用593 bp DIG标记DNA探针进行基因组Southern杂交，检测15.6 kb WT等位基因和4.3 kb靶向等位基因。
图2
图2。肉豆蔻酰化物的表达-p110α导致出血、血管缺损和胚胎发育不良
（A和B）Cre；E10.5的WT胚胎（表达Cre重组酶的WT胚）表现出正常表型。（C和D）Cre；千里拉-第110页E10.5的α胚胎显示卵黄囊血管系统有缺陷（C）和一个萎缩的身体，腹部有一个充满血液的大表皮下泡（D，箭头）。（E和F）Cre；E11.5时的WT胚胎。（G和H）Cre；千里拉-第110页E11.5处的α胚胎显示有缺陷的血管系统和卵黄囊中的异常血斑（G），以及形态异常的胚胎（H）。（I和J）Cre；WT胚胎在E12.5。（K和L）Cre；千里拉-第110页E12.5的α胚胎，卵黄囊中的血管支离破碎（K，箭头），出血区域心包腔扩大，充满血液（L，箭头）。（M和N）Cre；WT胚胎在E13.5。（O和P）Cre；甲基丙烯酸甲酯-第110页在E13.5的α胚胎中，卵黄囊血管界限不清，胚胎体异常（O），胚胎内出血区域广泛（P）。（Q和R）Cre；WT胚胎在E15.5。（S和T）Cre；甲基丙烯酸甲酯-第110页E15.5的α胚胎显示卵黄囊血管系统缺陷（S）和出血（T）。图片代表了所分析的434个胚胎。比例尺代表0.5厘米。
图3
图3。Cre表型的变异性；千里拉-p110α胚胎与X染色体失活无关
PCR产物是从CMV-Cre纯合子母亲和myr的胚胎中分离的卵黄囊纯化gDNA中产生的-第110页α重量/流量父亲十字架。在胚胎死亡发生的E9.5至E11.5期间，随机选择发育缺陷（E9.5时为1至5道，E10.5时为11至15道，E11.5时为21至25道）或出血（E9.5.时为6至10道，E10.5.时为16至20道，E11.5.时为26至30道）的胚胎。雌性和雄性在存活率或表型变异性方面没有明显差异。基因组PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳中可见。PCR检测男性和女性中441 bp的男性特异性基因SRY和245 bp的常染色体基因myogenin（Myog）的代表性结果。
图4
图4。Cre；千里拉-p110α胚胎血管极度扩张，壁不连续
（A） E15.5处的WT胚胎。（B和C）Cre；千里拉-第110页E15.5处的α胚胎显示大量出血。（D至F）H&E染色的胚胎矢状头部切片。（D） WT胚胎如（A）所示，表现出正常的组织学。（E和F）Cre；千里拉-第110页α胚胎如（B）和（C）所示，显示皮肤下的渗出物（箭头）。（G至I）胚胎头部矢状切面抗PECAM-1抗体免疫染色。（G） WT胚胎（A），显示正常血管（箭头）。（H和I）Cre；千里拉-第110页α胚胎（B和C），在出血区域血管极度扩张，壁不连续（箭头所示）。（J至L）H&E染色的胚胎背矢状切片。（J） WT胚胎（A），显示正常组织学。（K和L）Cre；千里拉-第110页α胚胎（B和C），显示外渗（箭头）。胚胎背矢状切片的（M至O）PECAM-1免疫染色。（M） WT胚胎（A），呈现正常血管（箭头所示）。（N和O）Cre；千里拉-第110页α胚胎（B和C），出血区域血管扩张，壁不连续（箭头所示）。PECAM-1免疫染色显示为棕色，显示血管。用X400放大拍摄H&E染色和PECAM-1免疫染色的照片。图片具有代表性。面板（A）中的条表示1厘米，并指示（A）到（C）的比例。
图5
图5。Cre；千里拉-p110α胚胎增加VEGF-A和HIF-1α信使核糖核酸
WT和Cre中VEGF-A、HIF-1α和HIF-1βmRNA表达水平；千里拉-第110页通过实时qRT-PCR分析α胚胎，实时qRT-PCR数据的图相对于GAPDH进行量化和归一化。归一化后计算与WT对照胚胎相比的平均倍数增加。误差线表示为平均值±SEM。双尾未配对t吨检验用于统计分析*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.P（P）>0.05被认为不显著（ns）。数据代表了2个独立实验，每组使用3~6个胚胎。
图6
图6。Cre；千里拉-无论PTEN和p85α水平升高，p110α胚胎都会激活AKT
（A） WT和Cre中p110α、p-AKT、AKT和eGFP的Western blot分析；千里拉-第110页E9.5至E11.5期间的α胚胎。（B） p110α、p-AKT和AKT的Western blot信号图根据β-肌动蛋白水平进行量化和标准化。（C） WT和Cre中p85α、p-PTEN和PTEN的Western blot分析；千里拉-第110页E9.5至E11.5期间的α胚胎。（D） p85α、p-PTEN和PTEN的Western blot信号图根据β-肌动蛋白水平进行量化和标准化。归一化后计算与WT对照胚胎相比的平均倍数增加。误差线表示为平均值±SEM。双尾未配对t吨检验用于统计分析*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.P（P）>0.05被认为不显著（ns）。数据代表了每组使用5个胚胎的4个独立实验。
图7
图7。肉豆蔻酰化-第110页α在所有组织中普遍表达
（A） Cre；E15.5的WT胚胎具有正常表型的混合遗传背景。（B） Cre；千里拉-第110页E15.5的α胚胎具有混合遗传背景，在胚胎中显示出广泛的出血区域。（C） WT胚胎的荧光图像如（A）所示，没有GFP信号。（D） Cre的荧光图像；甲基丙烯酸甲酯-第110页α胚胎如（B）所示，显示GFP信号的显著水平。GFP的荧光信号没有采用酶扩增。图片代表了所分析的14个胚胎。面板（A）中的条表示0.5 cm，并指示（A）到（D）的比例。
图8
图8。肉豆蔻酰化-p110α不仅在血管内皮细胞中表达，而且在非血管成纤维细胞中也表达
（A） 通道7处WT pMEF的GFP图像，未显示GFP信号。（B） Cre的GFP图像；千里拉-第110页第7代的αpMEF，揭示了GFP信号的显著水平。（C） 用Hoechst 33342染色（A）中显示的WT pMEF，以显示细胞核。（D） Cre的Hoechst 33342核酸染色；千里拉-第110页αpMEF如（B）所示。照片是用X100放大倍数拍摄的。面板（D）中的条形代表100μm，表示（A）至（D）的刻度。（E） WT和Cre中p110α、p-AKT和AKT的Western blot分析；千里拉-第110页αpMEF。（F） p110α、p-AKT和AKT的Western blot信号图。（G） WT和Cre中p85α、p-PTEN、PTEN和GFP的Western blot分析；千里拉-第110页αpMEF。（H） p85α、p-PTEN和PTEN的Western blot信号图。对于F和H，Western blot信号根据β-肌动蛋白进行量化和归一化，归一化后计算与WT对照pMEF信号相比的平均倍数增加。误差线表示为平均值±SEM。双尾未配对t吨检验用于统计分析*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.P（P）>0.05被认为不显著（ns）。数据代表了4个独立实验。
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