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.2016年8月1日；11（8）：e0160258。
doi:10.1371/journal.pone.0160258。 2016年eCollection。

Mic13对哺乳动物细胞中Crista连接的形成至关重要

鲁奇卡·阿南德 1, 瓦伦蒂娜·斯特雷克 2, 詹妮弗·乌尔巴赫 1, 伊尔卡·维蒂格 2 三 4, 安德烈亚斯·雷切尔 1
附属机构

Mic13对哺乳动物细胞中Crista连接的形成至关重要

鲁奇卡·阿南德等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

线粒体嵴通过嵴连接与内界膜相连，嵴连接参与调节氧化磷酸化、凋亡和脂质和蛋白质的输入。MICOS复合体决定了嵴连接的形成。我们进行了复合体分析，并将Mic13（也称为Qil1）鉴定为MICOS复合体的一个亚单位。我们表明，MIC13是一种与MICOS复合物的中心亚单位MIC60物理相互作用的内膜蛋白。使用CRISPR/Cas方法，我们生成了第一个MIC13缺失细胞系。这些敲除细胞显示嵴连接完全丢失，表明MIC13是嵴连接形成的严格要求。MIC13用于将MIC10、MIC26和MIC27组装到MICOS复合体中。然而，MIC60/MIC19/MIC25亚复合物的形成不需要这一点，这表明后者不足以形成嵴连接。MIC13对于组装呼吸链复合体和维持线粒体网络形态也是不可或缺的。尽管如此，缺乏MIC13导致线粒体呼吸适度减少。总之，我们表明MIC13在嵴连接形成中具有基本作用，呼吸链超复合体的组装与线粒体嵴形状无关。

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数字

图1
图1。使用复合体分析将MIC13鉴定为MICOS亚单位。
（A） 该图显示了在对照HEK293细胞中与MIC60和其他MICOS成分共聚集的蛋白质的标准化出现情况。利用该复合物组分图谱，MIC13被鉴定为MICOS组分。（B） 内源性MIC13、MIC60和MIC27抗体用于联合免疫沉淀。免疫前血清（PIS）作为对照。内源性MIC13可下调MIC60，在对照143B细胞中，MIC60和MIC27可下调MIC13，表明MIC13是MICOS复合物的一部分。（C） MIC13的序列比对表明，它与秀丽隐杆线虫到高等真核生物。
图2
图2。MIC13定位于线粒体内膜。
（A） 对照143B细胞中线粒体（以mito-GFP标记，绿色）和内源性MIC13（使用MIC13抗体，红色）或MIC13-FLAG（以抗FLAG标记）的代表性图像。Merge显示线粒体和MIC13的共定位。比例尺10μm。（B） 对照143B细胞的分离线粒体通过渗透性休克（OS）膨胀，然后用蛋白酶K（PK）处理或不处理。Triton-x-100（Tx100）用于渗透所有膜。TOM20、TIM23和TFAM分别用于外膜、内膜和基质标记。
图3
图3。MIC13 KO细胞无嵴连接。
（A） MIC13的免疫印迹显示敲除细胞系中的蛋白质完全丢失。（B） 对照组和MIC13KO线粒体的典型EM图像（我们分析了每个MIC13ko细胞系（N=2）中约40-50个线粒体。MIC13 KO细胞中CJs完全缺失，而对照细胞中几乎所有部分（40至50个线粒体，N=2）中都观察到1至5个CJs。（C） 使用SiRNA去除MIC13的HeLa细胞中MIC13免疫印迹。（D）对照和MIC13 SiRNA线粒体的代表性EM图像。
图4
图4。MIC13敲除导致更小但组装的MICOS复合物。
（A） 在针对MIC60的3%至18%丙烯酰胺梯度凝胶上，通过蓝色电泳（BNE）分离蛋白质复合物，复合物IV的coxVIa/b亚单位和ATP合成酶在印迹上显示，以证明样品负载相等且无影响。在对照HEK293细胞中，检测到约500KDa的MICOS。删除MIC13会导致MICOS复合物变小。（B） MIC13 KO细胞中MICOS复合物的复合体分析表明，较小的MICOS复合体（亚复合体）由MIC60、MIC19和MIC25组成。（C） 免疫印迹显示MIC13 KO细胞以及MIC13 siRNA处理的细胞中各种MICOS成分的稳态水平。MIC13缺失后，MIC10、MIC27和MIC26降低。（D） MIC10缺失细胞的免疫印迹检测MIC13和MIC60。
图5
图5。MIC13耗竭后，呼吸链复合物的稳定性和组装不变。
（A） 免疫印迹显示RC各亚单位的稳态水平。（B） 用考马斯染色的蛋白质复合物的蓝色天然电泳，以检测对照和MIC13 KO细胞中的主要呼吸链复合物。（C） 对照组和MIC13 KO1细胞的耗氧率绘制为直方图（平均值±SE，N=6）。显示了控制细胞和MIC13 KO1细胞的基础、泄漏、ETS（电子传输系统容量或最大呼吸）和ROX（剩余呼吸）。**，p值<0.01。（D） 添加指示的呼吸底物和抑制剂后，在洋地黄素渗透细胞中测量耗氧率。基础呼吸、苹果酸/谷氨酸（复合物I）、ADP、琥珀酸（复合物质II/III）和抗坏血酸/TMPD（复合物IV）呼吸被表示为方框图，在方框图上绘制中值和75/25百分位。此外，绘制了七个单独实验的所有数据值（Δ=实验1，×=实验2，◊ = 实验3，–=实验4，□ = 实验5，○ = 实验6，+=实验7）.*，p值<0.05；***，p值<0.001。
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这项工作得到了Sonderforschungsbereich 815，Deutsche Forschungsgemeinschaft的支持(网址：www.dfg.de)和海因里希·海因大学医学院Forschungskommission(http://www.medizin.hhu.de/forschung.html). 资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。