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.2016年9月19日;44(16):7804-16.
doi:10.1093/nar/gkw676。 Epub 2016年7月27日。

用mtZFNs反复或动态剂量控制治疗近完全消除突变mtDNA

附属公司

用mtZFNs反复或动态剂量控制治疗近完全消除突变mtDNA

Payam游戏等。 核酸研究. .

摘要

线粒体疾病通常与线粒体DNA(mtDNA)突变有关。在大多数情况下,突变型和野生型线粒体DNA共存,导致异质性。选择性地消除突变线粒体DNA,然后富集野生型线粒体DNA,可以挽救异质性细胞的病理表型。使用线粒体靶向锌指核酸酶(mtZFN)可通过位点特异性DNA裂解降解突变的mtDNA。在这里,我们描述了我们以前基于mtZFN的靶向mtDNA方法的实质性增强,通过迭代处理或精细控制mtZFN的表达,允许mtDNA异质性的近完全方向转移,这限制了非靶向催化和不希望的mtDNA拷贝数损耗。为了证明这种改进方法的实用性,我们从同一亲本来源产生了具有可变mtDNA突变水平的异质性细胞的等基因分布,无需克隆选择。对这些人群的分析表明,细胞的代谢特征发生改变,突变m.8993T>G mtDNA水平降低,与神经病变、共济失调和视网膜色素变性(NARP)相关。我们的结论是,基于mtZFN的方法为基础研究中的mtDNA异质性操作提供了手段,并可能为某些线粒体疾病的治疗干预提供策略。

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数字

图1。
图1。
使用mtZFN靶向m.8993T>G NARP突变的策略以及mtZFNs短期表达的异质性和拷贝数分析。(一个)实验的一般工作流程示意图,包括用共表达mtZFN单体和荧光标记蛋白的质粒瞬时转染异源细胞,基于FACS的表达mtZFN单体的细胞选择和mtZFN处理的细胞的表型评估。技术细节和质粒如(27)所述。(B类)使用mtZFN选择性降解m.8993T>G mtDNA的策略的详细示意图。传统的二聚体工程化mtZFN被定向到邻近(COMPa,绿色)或包括(NARPd,红色)突变碱基位置的序列。这两种单体应仅在所示核苷酸发生突变时与底物结合,而不是与野生型序列结合。DNA双链断裂只能引入突变的mtDNA分子,导致异质性的转变。(C类)瞬时表达的FACS富集细胞mtDNA的最后一个循环热PCR限制性片段长度多态性(RFLP)分析表明mtZFN构建对。143B和N100分别作为野生型和100%突变型消化对照。(D类)瞬时转染mtZFN或对照载体的富含FACS细胞的几个生物复制品的RFLP异质性数据的量化。如图所示,数据来自转染后24小时、18天和28天的测量结果。使用双尾Student’s-测试,P(P)=0.027(24小时);P(P)=0.00167(18天);P(P)=0.00146(28天);n个= 3. ‘% 未注册。细胞”表示这些实验中使用的N80细胞系的基线异质性(E类)用qPCR对(C)中测试的样本进行四份mtDNA拷贝数分析。误差线=1 S.D(F类)野生型mtDNA异质性随mtZFN配对NARPd(+)/COMPa(−)的迭代表达和恢复周期而改变。插入;mtZFN的mtDNA异质性中fold-变化的量化以及每次转染/FACS/恢复的对照。在转染后28天对呈现的异质性进行测量未注册。cels’表示在这些实验中使用的N80细胞系的基线异质性。
图2。
图2。
mtZFN的剂量会显著改变异质性转移的效率和mtDNA拷贝数的耗竭/补充情况。(一个)代表性点图显示了用于分离“高”和“低”mtZFN表达转染体的典型FACS门控策略。(B类)转染后24小时,用SDS-PAGE对富含FACS的样品中的总细胞蛋白进行Western blot分析,用HA(NARPd(Nd))或FLAG(COMPa(Ca))表位抗体检测mtZFN的表达。β-肌动蛋白和一段考马斯染色凝胶(CBB)显示为负荷控制。p、 前体亚型;m、 成熟亚型。(C类)瞬时表达“高”或“低”mtZFN或对照载体的细胞mtDNA的最后一个循环热PCR RFLP。(D类)量化来自瞬时mtZFN或控制载体表达的几个生物复制品的整理异质性数据。如图所示,数据来自转染后24小时、18天和28天的测量结果。使用双尾Student’s-测试,P(P)=0.044(‘低’24小时);P(P)=0.032(“低”18天);P(P)=0.011(“低”28天);n个= 3. ‘% 未注册。cells’表示这些实验中使用的N80细胞系的基线异质性。(E类)用qPCR对D中检测的样本进行四份mtDNA拷贝数分析。使用双尾Student’s-测试,P(P)=0.036(mtZFN,24小时)。误差线=1 S.D。
图3。
图3。
使用四环素敏感的3′锤头状核酶(HHR)对mtZFN表达的动态控制揭示了对异质性和mtDNA拷贝数缺失/补充谱的剂量依赖性影响。(一个)含锤头状核酶(HHR)的mtZFN转基因示意图。当转录时,编码mtZFN的mRNA在HHR切割后发生组成性降解,导致翻译蛋白的数量大大降低。然而,在四环素存在下,HHR元素稳定,抑制催化并产生大量翻译蛋白。CMV、巨细胞病毒启动子、MTS、线粒体靶向序列、F、FLAG表位标签、NES、核输出信号、BGH pA、牛生长激素多聚腺苷酸化信号。(B类)转染后24小时对富含FACS样品的总细胞裂解物进行Western blot分析,检测培养基中指示浓度的四环素(tet)或强力霉素(doxycycline)中COMPa(−)mtZFN或COMPa。β-肌动蛋白和一段考马斯染色凝胶(CBB)显示为负荷控制。p、 前体亚型;m、 成熟亚型。(C类)量化来自瞬时mtZFN表达的几个生物复制品的整理异质性数据。转染后28天进行测量。填充的黑色三角形表示四环素浓度的光谱(0、25、250μM)。n个=3,使用双尾Student’s进行统计分析-测试,P(P)=0.0015(矢量/mtZFN),P(P)=0.0002(矢量/mtZFN-HHR,0μM),P(P)=0.009(mtZFN-HHR,0μM/mtZFN-HHR、250μM)未注册。cells’表示这些实验中使用的N80细胞系的基线异质性。(D类)用qPCR对C中检测的样本进行四份mtDNA拷贝数分析。使用双尾Student’s-测试,P(P)= 0.047. 误差线=1 SD。
图4。
图4。
mtZFN治疗挽救了与m.8993T>G相关的线粒体缺陷,并伴随着细胞代谢的重新布线。(一个)含80%m.8993T>G(N80)的空载体转染杂交细胞和含NARPd(+)-HHR/COMPa(−)-HHR转染的同源细胞的耗氧率(OCR),培养基中存在25μm(N10)或250μm(F45)四环素。这些细胞系是在一次实验中同时产生的。使用双尾学生的-测试(P(P)= 0.0001865,n个= 7). (B类)N80、N45和N10细胞中与ATP相关的线粒体呼吸,计算为存在或不存在寡霉素时OCR的比率。(C类)N80、N45和N10细胞的能量电荷状态分析,使用LC-MS通过既定方法检测磷酸腺苷物种的值进行计算(35)。(D类)基于LC-MS的代谢组学测量的N80、N45和N10细胞内代谢物的主成分分析(PCA)。显示了主成分1和主成分2的得分图,分别解释了55.7%和16.1%的总方差。(E类)通过LC-MS测量的N80、N45和N10细胞内柠檬酸和乌头酸的细胞内水平的热图表示。值得注意的是,发现N80和N45之间以及N80和N1之间的柠檬酸丰度存在显著差异,而与N80细胞相比,N10中的乌头酸显著上调(补充图S8)。

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引用人

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    1. Anderson S.、Bankier A.T.、Barrell B.G.、de Bruijn M.H.、Coulson A.R.、Drouin J.、Eperon I.C.、Nierlich D.P.、Roe B.A.、Sanger F.等人。人类线粒体基因组的序列和组织。自然。1981;290:457–465.-公共医学
    1. Lightowlers R.N.、Taylor R.W.、Turnbull D.M.突变导致线粒体疾病:有哪些新情况,仍然存在哪些挑战?科学。2015;349:1494–1499.-公共医学
    1. Viscomi C.、Bottani E.、Zeviani M.线粒体疾病治疗中的新概念。生物化学。生物物理学。《学报》。2015;1847:544–557.-公共医学
    1. Moraes C.T.这是一颗专门从患者细胞中消除突变线粒体基因组的神奇子弹。EMBO Mol.Med.2014;6:434–435.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Srivastava S.,Moraes C.T.通过线粒体靶向限制性内切酶操纵线粒体DNA异质性。嗯,分子遗传学。2001;10:3093–3099.-公共医学

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