In silico synchronization reveals regulators of nuclear ruptures in lamin A/C deficient model cells

doi:10.1038/srep30325

.2016年7月27日6:30325。

doi:10.1038/srep30325。

电子同步显示层粘连蛋白A/C缺陷模型细胞核破裂的调节因子

J罗比恩斯¹, F莫伦伯格¹, T西普拉斯^1 2, T D J角^1 2, M Verschuuren先生¹, W H De Vos公司^1 2

附属公司

¹比利时安特卫普大学兽医学系细胞生物学和组织学实验室。
²比利时根特大学分子生物技术系细胞系统和成像研究小组（CSI）。

PMID： 27461848
预防性维修识别码：项目经理4962089
内政部： 10.1038/srep30325

电子同步显示层粘连蛋白A/C缺陷模型细胞核破裂的调节因子

J罗比恩斯等人。科学代表. 2016.

.2016年7月27日6:30325。

doi:10.1038/srep30325。

作者

J罗比恩斯¹, F莫伦贝格¹, T西普拉斯^1 2, T D J角^1 2, M Verschuuren先生¹, W H De Vos公司^1 2

附属公司

¹比利时安特卫普大学兽医学系细胞生物学和组织学实验室。
²比利时根特大学分子生物技术系细胞系统和成像研究小组（CSI）。

PMID： 27461848
预防性维修识别码：项目经理4962089
内政部： 10.1038/srep30325

摘要

核膜是核结构和功能的关键调节器。椎板病患者细胞的细胞核经历核膜的反复破坏，导致核和细胞质成分的短暂混合。这些事件的确切原因和后果尚不完全清楚，但其随机发生使深入分析复杂化。为了解决这个问题，我们建立了一种方法，能够对自发核破裂进行定量研究，该方法基于牢固结合的核参考标记物和在破裂过程中在细胞核和细胞质之间穿梭的荧光蛋白的共同表达。两名记者的微创成像，结合自动跟踪和个人破裂事件的电子同步，可以提取破裂频率和恢复动力学信息。使用这种方法，我们发现破裂频率与层粘连蛋白A/C水平呈负相关，并且可以通过阻断肌动球蛋白收缩性或抑制乙酰转移酶蛋白NAT10，在基因组编辑的LMNA敲除细胞中降低破裂频率。核信号恢复遵循由破裂事件严重程度共同决定的动力学，并且可能通过敲除ESCRT-III复合组分CHMP4B而延长。总之，我们的方法揭示了核破裂诱导和修复的调节器，这可能在疾病发展中起关键作用。

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数字

**图1。核破裂的稳健检测。**
转染MEF-LKO细胞(一)H2B-GFP和(b条)mCherry-NLS显示重复的核破裂（破裂的时间点用红点标记），核信号的平均强度突然降低；(**c（c）**)H2B/NLS信号比的时间导数（ΔH/N）显示出强烈的同步增长。虚线表示截止值，在其上方检测到破裂；(d日)NLS通道全时间记录的波形图（箭头表示破裂事件）。

**图2。*生物信息学*核破裂的同步性。**
(一)单个MEF-LKO细胞的时间轨迹（n = 216轨道），显示核强度波动和多次破裂事件（红色标记）。下面矩形选择的放大视图；(b条)从所有时间轨迹中提取的单个破裂事件与核破裂时刻同步（红色），并标有恢复半时（黄色）。下面矩形选择的放大视图。(**c（c）**)恢复半衰期直方图，与最适合的双峰密度分布的单个分量叠加，显示出两个不同的种群，对应快速（红色）和缓慢（橙色）恢复；(d日)用平均归一化信号表示破裂后核信号的双峰恢复动力学 ± fast（T）的标准误差（阴影带）_第页≤30 min）和缓慢种群（T_第页 > 30 最小值）。黑色虚线表示破裂时刻；为了清晰起见，Y轴已被裁剪；(**e（电子）**)线性拟合散点图（R² = 0.519）和99%置信区间表明，恢复半衰期部分随破裂的严重程度而定（表示为核强度下降的程度）。

**图3。破裂时局部染色质凝集。**
(一)转染H2B-GFP和NLS-mCherry的MEF-KO细胞的蒙太奇切片显示，核破裂后出现明显的核变形（红点）和相邻的染色质凝集，H2B信号强度随之增加。单个通道的选定时间点以灰度显示，并与NLS通道合并为青色，H2B通道合并为红色；(b条)中所示矩形区域的放大视图(一)叠加破裂前核形状（00）的轮廓（红色虚线） h： 54个 m）；(**c（c）**)XYT波形图（通过时间呈现单个共焦截面）显示了核破裂后的明显变形（红色箭头）以及随后H2B信号强度的局部增加。

**图4。HT-LKO细胞再现了层粘连A/C缺乏的特征。**
(一)定量PCR显示减少了6倍以上（以对数表示₂ddCt值的倍数变化）*LMNA公司*与HT-WT克隆相比，不同LKO克隆中的转录物；(b条)定量免疫荧光显示HT-LKO菌落中a型层粘连蛋白水平显著降低，接近背景水平（虚线）；(**c（c）**)层粘连蛋白A/C的蛋白质印迹显示HT-LKO细胞中不存在这两种蛋白质；(d日)HT-LKO细胞的免疫染色和核反染显示了其异常的核形态，与HT-WT细胞相比，层粘连蛋白A（绿色）的实际缺失和层粘连膜B（红色）的局部缺失（箭头）；(**e（电子）**)H2B-GFP转染后的时间推移记录表明，HT-LKO细胞与HT-WT细胞相比，其核可塑性增加，表现为其更大的投影面积（∑面积）和轮廓变化（∑轮廓）；(**（f）**)HT-LKO核的平均核圆度较低（虚线表示圆度为0.85），核圆度波动较高（平均+95%置信区间）；为了清晰起见，Y轴已被裁剪；(克)这意味着随着时间（p）的循环，变化系数（CoV）显著增大 < 0.001). (小时)HT-LKO细胞的核破裂发生率高于HT-WT细胞（p < 0.001); (我)C4 HT-WT和L2 HT-LKO单元的NLS信道的典型蒙太奇，以及相应的NLS/H2B比率测量（灰色编码条形图）。破裂事件的时刻用红点表示。条形图反映平均值 ± 标准误差（n = 曲目数）。

**图5。核破裂动力学可以通过实验进行调节。**
(一)Blebbistatin（BLEB）降低L2 HT-LKO和C4 HT-WT细胞的破裂频率（p < 0.001); (b条)显性阴性KASH结构（DN-KASH）的表达对L2 HT-LKO或C4 HT-WT细胞的破裂频率没有显著影响；(**c（c）**)重塑蛋白（REMOD）显著增加循环性（p < 0.001）在L2 HT-LKO或C4 HT-WT细胞中表达。为了清晰起见，Y轴已被裁剪；(d日)重塑蛋白显著降低了L2 HT-LKO细胞随时间循环的变异系数（CoV）（p < 0.01），但在C4 HT-WT细胞中不存在；(**e（电子）**)重塑蛋白降低L2 HT-LKO细胞的破裂频率（p < 0.05），但在C4 HT-WT细胞中不存在；(**（f）**)siRNA-介导的击倒*CHMP4B型*（siCHMP4B）导致>95%的减少（以对数表示₂ddCt值的倍数变化）*CHMP4B型*与非靶向对照siRNA（siNT）相比的转录水平；(克)siRNA-介导的击倒*CHMP4B型*与非靶向对照siRNA相比，CHMP4B蛋白水平降低了50%以上；(小时)siRNA-介导的击倒*CHMP4B型*增加了核回收的中场休息时间（p < 0.05). 条形图反映平均值 ± 标准误差（n = 单元格数量）。

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1. Broers J.L.V.核Lamins:Laminopathies及其在早衰中的作用。生理学。第86版，967–1008（2006）。-公共医学
1. De Vos W.H.等人。在层粘连疾病中，核膜的重复破坏会导致细胞区室化的暂时丧失。嗯，分子遗传学。20, 4175–4186 (2011).-公共医学
1. Houben F.等人，《椎板病中PML颗粒的细胞质定位》。组织化学。细胞生物学。139, 119–134 (2013).-公共医学
1. Hatch E.和Hetzer M.在发育和疾病中突破核膜。《细胞生物学杂志》。205, 133–141 (2014).-项目管理委员会-公共医学
1. de Noronha C.M.等人…HIV-1 Vpr诱导的核膜结构和完整性的动态破坏。《科学》2941105–1108（2001）。-公共医学

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[5] Houben F.等人，《椎板病中PML颗粒的细胞质定位》。组织化学。细胞生物学。139, 119–134 (2013).-公共医学

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[7] Hatch E.和Hetzer M.在发育和疾病中突破核膜。《细胞生物学杂志》。205, 133–141 (2014).-项目管理委员会-公共医学

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