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.2016年8月1日；214(3):275-91.
doi:10.1083/jcb.201603105。 Epub 2016年7月25日。

Syntaxin-17将PINK1/parkin依赖的线粒体小泡传递到溶酶体系统

吉安·卢卡·麦克莱兰 1, 悉尼A Lee 1, 海蒂·M·麦克布莱德 2, 爱德华·A·丰 三
附属公司

Syntaxin-17将PINK1/parkin依赖的线粒体小泡传递到溶酶体系统

吉安·卢卡·麦克莱兰德等。 J细胞生物学. .

摘要

线粒体被认为是独立的细胞器，与内吞和生物合成途径物理上分离。然而，最近的工作揭示了PINK1/帕金依赖性囊泡运输途径，其中氧化或受损的线粒体内容物被选择性地输送到晚期内体/溶酶体进行降解，这为线粒体确实整合在内膜系统内提供了证据。鉴于线粒体尚未被证明使用经典的可溶性NSF附着蛋白受体（SNARE）机制进行融合，线粒体衍生的囊泡（MDV）靶向内体区室的机制尚不清楚。在这项研究中，我们确定syntaxin-17是将应激诱导的PINK1/帕金依赖性MDV递送到晚期内体/溶酶体所需的核心线粒体SNARE。Syntaxin-17仍与成熟MDV相关，并与SNAP29和VAMP7形成三元SNARE复合物，以依赖于同型融合和空泡蛋白分选（HOPS）系链复合物的方式介导MDV内溶酶体融合。Syntaxin-17可以追溯到最后一个真核生物的共同祖先，暗示去除受损线粒体内容物可能是细胞中最早的小泡运输途径之一。

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数字

图1。
图1。
Stx17在线粒体衍生小泡（MDV）上进行生化富集。（A） 无细胞MDV芽殖试验流程图（有关完整详细信息，请参阅材料和方法）。（B） 分离小鼠肝脏（见材料和方法），用SDS-PAGE分离40µg重膜（HM）、可溶性（S）和轻膜（LM）组分，并用免疫印迹法进行分析。（C） 通过SDS-PAGE分离在细胞液和/或50µM抗霉素A（anti-A）存在下培养的体外MDV出芽试验中的胰蛋白酶化上清液和颗粒，以及反应颗粒（线粒体），并通过免疫印迹分析。星号表示非特定带。（D） 在不连续的蔗糖梯度上分馏大规模芽变反应（与胞浆和50µM抗霉素A孵育），用SDS-PAGE分离并用免疫印迹分析。（E） D中探测的蛋白质的强度分布，表示为其最大强度的一部分。
图2。
图2。
线粒体Stx17病灶的动力学和超微结构。（A） 通过旋转圆盘共焦显微镜对表达YFP-Stx17（绿色，800ms暴露时间）并用MitoTracker深红色FM（红色，50ms暴露时间）染色的未处理COS7细胞中Stx17囊泡形成和释放的活细胞观察。经过的时间显示在每个合并图像的右下角。白色箭头表示Stx17+在小管上形成并随后与小管分离的结构。棒材：（全图）10µm；（放大）0.5µm。（B） Stx17在释放前集中于小管。在来自A的同一时间序列中，YFP-Stx17信号（右）集中于MitoTracker标记的小管（左）。YFP-Stx17图像表示为热图，亮度/对比度已调整（从a开始），因此完全形成的结构几乎饱和，可以清楚地看到信号的浓度。棒材，0.5µm。（C） 转染GFP-Stx17的活细胞的SD-OSR图像。Stx17信号位于线粒体外膜上，白色箭头表示Stx17位于OMM上。蓝色虚线描绘了线粒体内部。条形，200 nm。（D） 表达YFP-Stx17的COS7细胞的代表性透射电镜照片，对YFP进行免疫染色，并用1.4 nm金颗粒和银增强（SE）标记。固定前用25µM抗霉素A处理细胞45分钟。黑色箭头表示YFP-Stx17位于线粒体外膜的细胞溶质表面。条形图：（左上角）250 nm；（左上插图），50纳米；（右上角）250纳米；（左下角）200纳米；（右下角）500 nm。（E） 在抗霉素A处理和未处理的表达YFP和YFP-Stx17的细胞中，来自D.Bars的细胞中线粒体外膜每距离YFP阳性病灶数量的定量表示平均值±SEM；n个=每种情况下80–112个线粒体；***，P<0.001。（F） 来自D.Bars的细胞中带有YFP-Stx17病灶的线粒体比例的量化表示平均值。（G） 表达YFP-Stx17的COS7细胞的代表性透射电镜照片，对YFP进行免疫染色，并用10 nm金颗粒标记。红色箭头表示线粒体外膜细胞溶质表面线粒体膜变形处存在金颗粒。棒材，50 nm。
图3。
图3。
Stx17定位于依赖泊车/PINK1的MDV。（A） 固定前用25µM抗霉素A处理45分钟的COS7细胞的透射电子显微照片。插图（黑框）显示了与线粒体外膜相连的出芽轮廓。白色和黑色箭头分别表示囊泡内外膜，黑色箭头表示囊泡颈部。条形图：（全图像）100 nm；（插入）50 nm。（B） 用指示的siRNA转染COS7细胞，用SDS-PAGE分离未处理细胞中的60µg裂解物，并对指示的蛋白质进行免疫印迹。星号表示非特定带。（C） 抗霉素A处理细胞PDH E2/E3bp（绿色）和TOM20（红色；Hoescht，蓝色）免疫染色的典型共焦图像。选择性，PDH E2/E3bp+/TOM20（TOM20）−与MDV对应的结构用红色箭头表示。棒材：（左）10µm；（右）2µm。（D） PDH E2/E3bp数量的量化+/TOM20（TOM20）−经或不经25µM抗霉素A处理45分钟的C细胞中每细胞的MDV。条形代表平均值±SEM，n个=每种情况23–29个单元格。***，P<0.001；不重要。（E） U2OS:GFP-parkin（青色）细胞的共聚焦图像，表达Flag-Stx17（品红色），用25µM抗霉素a处理2 h，固定并免疫染色PDH E2/E3bp（黄色）和TOM20（蓝色）。插图中的红色箭头表示PDH E2/E3bp+/TOM20（TOM20）−与GFP-parkin和Flag-Stx17共同定位。棒材：（全图）10µm；（插图）1µm。（F） 通过E中合并插图中绘制的3µm线绘制的强度图。显示了E中指示的MDV以及线粒体（mito）。A.U.，任意单位。（G） COS7细胞的代表性透射电子显微照片，用对照siRNA（ctrl-siRNA）或靶向parkin的siRNA（siParkin）或PINK1（siPINK1）转染，表达YFP-Stx17，对YFP进行免疫染色，并用1.4nm金颗粒和银增强（SE）标记。细胞在固定前用25µM抗霉素A处理45分钟或不处理。红色箭头表示YFP-Stx17信号簇。M、 线粒体；C、 胞浆。条形，100 nm。（H） 在抗霉素A处理和未处理的表达YFP-Stx17的细胞中，来自G.Bars的细胞中线粒体外膜每距离YFP阳性病灶数量的定量表示平均值±SEM；n个=每种情况下105–207个线粒体；***，P<0.001。
图4。
图4。
帕金/PINK1依赖型MDV的溶酶体周转需要Stx17。（A） 使用两种不同的抗体通过免疫印迹检测COS7细胞中的Stx17沉默。（B） 表达LAMP1-mRFP（品红色）的细胞经抗霉素A处理后的典型共焦图像，PDH E2/E3bp（黄色）和TOM20（青色；Hoescht，蓝色）固定并免疫染色。PDH E2/E3bp+/TOM20（TOM20）−指示LAMP1的正（红色箭头）或负（蓝色箭头）结构。棒材：（主要）10µm；（插图）2µm。（C） PDH E2/E3bp百分比的量化+/TOM20（TOM20）−在来自B.Bars的抗霉素A处理细胞中与LAMP1-mRFP共定位的MDV代表平均值；n个=对照siRNA和siStx17分别为29和25个细胞；****，P<0.0001。（D） siStx17细胞中MDV转换的脉冲相分析。在转染对照siRNA（红线）或靶向Stx17（蓝线）的siRNA的COS7细胞中，用25µM抗霉素A脉冲细胞45分钟，然后在固定前用缺乏药物的培养基追踪0.5至2小时。PDH E2/E3bp的数量+/TOM20（TOM20）−对指定时间内的结构进行计数。条形代表平均值±SEM；n个=每种情况19–23个细胞；**，P<0.01；***，P<0.001。根据拟合的衰变图计算MDV半衰期（见材料和方法；r2=0.98，对于对照siRNA和r2=0.91（对于siStx17）。（E） Stx17沉默延迟了驻车蛋白与MDV的分离。U2OS:GFP-parkin细胞转染所示siRNA，用25µM抗霉素A处理4 h，然后固定并免疫染色PDH E2/E3bp（红色）和TOM20（蓝色）。PDH E2/E3bp+/汤20−指示对于GFP parkin（绿色）也是阳性（箭头）或阴性（圆圈）的MDV。棒材，5µm。（F） PDH E2/E3bp百分比的量化+/TOM20（TOM20）−在E.Bars细胞中与GFP-parkin共定位的MDV代表平均值；n个=对照siRNA和siStx17分别为22和19个细胞；****，P<0.0001。（G） 抗霉素A处理的U2OS:GFP-parkin细胞的透射电子显微照片，对GFP进行免疫染色，并用1.4纳米金颗粒标记。黑盒子（左）放大了OMM（右）细胞溶质表面上的GFP-parkin簇。M、 线粒体。条形图：（左）100 nm；（右）50 nm。（H） 抗霉素A处理的U2OS:GFP-parkin细胞的透射电镜照片，转染对照siRNA（左）或靶向Stx17的siRNA（siStx17，右），对GFP进行免疫染色，并用1.4 nm金颗粒标记。黑色箭头表示GFP-parkin.M，线粒体的细胞溶质簇；LD，脂滴。条形，500 nm。
图5。
图5。
MDV营业额需要Stx17相关SNARE SNAP29和VAMP7。（A） COS7细胞中内源性SNAP29和Flag-VAMP7或Flag-VAMP8与YFP-Stx17的共免疫沉淀，使用抗GFP抗体进行免疫沉淀。通过SDS-PAGE分离免疫沉淀物（IP）以及8%的输入，并对所示蛋白进行免疫印迹。（B） U2OS:GFP-parkin细胞表达标记的VAMP7或VAMP8（黄色），用25µM抗霉素A处理2 h，然后固定并免疫染色PDH E2/E3bp（青色）和TOM20（洋红）。箭头表示PDH E2/E3bp+/TOM20（TOM20）−与相关VAMP共同定位的结构。棒材：（主要）20µm；（变焦）1µm。（C） PDH E2/E3bp百分比的量化+/TOM20（TOM20）−与B的U2OS细胞中的VAMP7（红点）或VAMP8（蓝点）共定位的结构，处理2和4小时。条形代表平均值；n个=20–22个单元格；**，P<0.01；***，P<0.001。（D） PDH E2/E3bp百分比的量化+/TOM20（TOM20）−用25µM抗霉素A处理COS7细胞45分钟后，与VAMP7（红点）或VAMP8（蓝点）共定位的结构。条形代表平均值；n个=VAMP7和VAMP8分别为27和29个单元格；****，P<0.0001。（E） Stx17-相关SNARE在U2OS:GFP-parkin细胞中沉默，并通过免疫印迹证实沉默。（F） U2OS的典型共焦图像：转染有指示siRNA和LAMP1-mRFP（品红色）的GFP-parkin细胞，用25µM抗霉素A处理2 h，然后固定并免疫染色PDH E2/E3bp（黄色）和TOM20（青色）。PDH E2/E3bp+/汤20−指示了LAMP1的正（红色箭头）或负（蓝色箭头）的结构。棒材：（主要）10µm；（变焦）1µm。（G） PDH E2/E3bp百分比的量化+/TOM20（TOM20）−来自F.Bars的U2OS细胞中与LAMP1-mRFP共定位的结构代表平均值；n个=每种情况23–26个细胞；***，P<0.001。（H） PDH E2/E3bp百分比的量化+/TOM20（TOM20）−在抗霉素A处理的COS7细胞中与LAMP1-mRFP共定位的结构。条形代表平均值；n个=每种情况24–27个细胞；*，P<0.05；***，P<0.001。（一） 在内源性Stx17和VAMP7沉默的COS7细胞中，GFP-Stx17、Flag-VAMP7与LAMP1-mRFP以1:3的比例表达。GFP和pcDNA作为对照质粒。对细胞进行裂解，用SDS-PAGE分离20µg细胞裂解液，并对所示蛋白进行免疫印迹。星号表示非特定带。注意，抗内源性VAMP7的抗体不能识别Flag-VAMP7，因为该结构是使用小鼠的cDNA创建的。（J） PDH E2/E3bp的定量+/TOM20（TOM20）−在GFP阳性、抗霉素A处理的I.Bars细胞中与LAMP1-mRFP共定位的结构代表平均值；n个=每种情况24–29个细胞；***，P<0.001。
图6。
图6。
操纵Stx17/VAMP7零层会影响复杂地层和MDV周转。（A） 人类R-SNARE蛋白SNARE结构域的一级序列比对。箭头表示参与SNARE三元络合物中央离子层的保守精氨酸。（B） 内源性SNAP29和VAMP7与内源性Stx17免疫沉淀与抗Stx17抗体共免疫沉淀，从未经治疗和抗霉素A处理的COS7细胞共免疫沉淀。Anti-GFP用作控件。通过SDS-PAGE分离免疫沉淀物以及5%的输入，并对所示蛋白进行免疫印迹。请注意，由于免疫沉淀样品中甘油含量与输入相比增加，VAMP7带在免疫沉淀通道中发生移动，导致SDS-PAGE迁移较慢。（C） Diao等人（2015）（PDB ID 4WY4）中解决的由Stx17（黄色）、SNAP29（绿色）和VAMP8（洋红）形成的三元SNARE络合物的中心离子层结构。显示参与残留物。注意，VAMP8中的精氨酸-37等同于VAMP7中的精胺酸-150。（D） 野生型（WT）或突变型（Q196R）YFP-Stx17在COS7细胞中表达，然后将其固定并制备免疫荧光（YFP-St x17，绿色；Hoescht，蓝色），或者在插入物的情况下，免疫EM M，线粒体；C、 胞浆。棒材：（主要）20µm；（变焦）50 nm。（E） 从表达空的YFP载体WT或突变体（Q196R）YFP-Stx17的COS7细胞中共免疫沉淀内源性SNAP29和VAMP7，使用抗GFP抗体进行免疫沉淀。通过SDS-PAGE分离免疫沉淀物以及2.5%的输入，并对所指示的蛋白质进行免疫印迹。（F和G）与Q196R相比，YFP-Stx17 WT共免疫沉淀的SNAP29（F）和VAMP7（G）的量的量化，标准化为输入。条形代表平均值±SEM；n个=3个实验；**，P<0.01；不另作说明，不重要。
图7。
图7。
SNARE复合体形成和MDV周转需要适当的零层比率。（A） 基于Diao等人解决的结构，由Stx17（红色）、SNAP29（绿色）和VAMP7/8（蓝色）组成的三元复合物中零层残基的组织和突变（Diao等人，2015；PDB ID 4WY4）。（B） VAMP7和VAMP8的域结构。箭头表示SNARE域中的保守零层残留物。TM，跨膜结构域。（C） 标记的VAMP7和VAMP8构建物在COS7细胞中表达，然后固定并免疫Flag（绿色）和LAMP2（红色）。棒材：（主要）10µm；（插图）2µm。（D） 使用抗GFP抗体在COS7细胞中与YFP、YFP-Stx17 WT或Q196R共免疫沉淀内源性SNAP29和标记VAMP7或VAMP8零层突变体。通过SDS-PAGE分离免疫沉淀物以及8%的输入，并对所示蛋白进行免疫印迹。（E和F）量化YFP-Stx17 WT与Q196R相比免疫沉淀的SNAP29（E）和标记VAMP7和VAMP8（F）的数量，并归一化为输入。条形代表平均值±SEM；n个=3个实验；***，P<0.001；不重要。（G） 在内源性Stx17和VAMP7沉默的COS7细胞中，Flag-Stx17（WT或Q196R）、Flag-VAMP7（WT或R150Q）和LAMP1-YFP以3:3:1的比例表达（pcDNA3用作Flag载体的对照）。对细胞进行裂解，用SDS-PAGE分离20µg细胞裂解液，并对所示蛋白进行免疫印迹。（H） PDH E2/E3bp的定量+/TOM20（TOM20）−在抗霉素A处理的COS7细胞中与LAMP1-YFP共定位的结构表示平均值；n个=每种情况下18–30个细胞；***，P<0.001；不另作说明，不重要。
图8。
图8。
Stx17对于去极化诱导的有丝分裂是不必要的。（A） U2OS:GFP-parkin细胞（葡萄糖上生长）经20µM CCCP或DMSO处理24小时的典型共焦图像。通过DNA固定和免疫染色（红色）以及Hoescht 33342（蓝色）复染来监测噬菌体。保留线粒体的细胞用星号标记。为了让读者更清楚地看到线粒体DNA（mtDNA）的存在，对Hoescht图像（与核DNA[nDNA]相关）进行阈值化，并从总DNA染色中减去，以生成单独的mtDNA图像（底行）。棒材，20µm。（B） 定量A.Bars中细胞保留线粒体的百分比代表平均值±SEM；n个=每种条件下重复3个细胞，每种条件每次重复计数>100个细胞。***，P<0.001。（C） U2OS:GFP parkin的代表性共聚焦图像（在葡萄糖上生长的细胞用20µM CCCP或DMSO处理1小时，以监测GFP parkin[绿色]募集[用星号标记的细胞]到线粒体[TOM20，红色；Hoescht，蓝色]）。棒材，20µm。（D） 细胞百分比的量化显示来自C.的细胞中的parkin向线粒体募集。条形表示平均值±SEM；n个=每种条件下重复3个细胞，每种条件每次重复计数>100个细胞；***，P<0.001；不另作说明，不重要。
图9。
图9。
HOPS复合体在MDV周转期间充当系绳。（A） HOPS亚单位Vps41存在于体外生成的MDV上。通过SDS-PAGE分离在图1D所示的无细胞分析中产生的等量纯化MDV（相当于图1D中的分数16）（含胞浆和50µM抗霉素a），以及梯度底部存在的材料（相当于表1D中分数22），并对所示蛋白质进行免疫印迹。Eps15作为可溶性蛋白质的对照物。（B） 表达空YFP载体（YFP）、野生型（WT）或突变型（Q196R）YFP-Stx17的COS7细胞内源性Vps41的共免疫沉淀；注意，印迹裁剪在对应于YFP的～30-kD带以上，使用抗GFP抗体进行免疫沉淀。通过SDS-PAGE分离免疫沉淀物以及2.5%的输入，并对所示蛋白进行免疫印迹。（C） 使用抗GFP抗体免疫沉淀，从表达YFP或YFP-Stx17的对照、Vps39-或Vps41-缺失COS7细胞共免疫沉淀内源性SNAP29和VAMP7。通过SDS-PAGE分离免疫沉淀物以及2.5%的输入，并对所示蛋白进行免疫印迹。（D） 转染指示siRNA的COS7细胞的免疫印迹分析。（E）转染指示的siRNA和LAMP1-YFP（绿色）的COS8细胞的典型共焦图像，这些细胞用25µM抗霉素A处理45分钟，然后固定并免疫染色PDH E2/E3bp（红色）和TOM20（蓝色）。PDH E2/E3bp+/TOM20（TOM20）−指示LAMP1的正（红色箭头）或负（蓝色箭头）结构。棒材，2µm。（F） PDH E2/E3bp百分比的量化+/TOM20（TOM20）−大肠杆菌细胞中与LAMP1-YFP共定位的结构代表平均值；n个=每种情况下30–35个细胞；***，P<0.001。（G） Stx17介导的MDV晚期内体融合模型。Stx17在萌芽期间被招募到MDV中，很可能是从OMM上的扩散池中动员而来。Stx17以HOPS依赖的方式与SNAP29和VAMP7在晚期内体形成三元SNARE复合物，以介导融合。
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