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.2016年7月26日;11(1):55.
doi:10.1186/s13024-016-0121-4。

miR-27a和miR-27b通过靶向PTEN诱导的假定激酶1(PINK1)调节受损线粒体的自噬清除

附属公司

miR-27a和miR-27b通过靶向PTEN诱导的假定激酶1(PINK1)调节受损线粒体的自噬清除

Jaekwang Kim先生等。 摩尔神经变性剂. .

摘要

背景:PINK1和PARKIN的功能丧失突变是常染色体隐性帕金森病(PD)最常见的病因。PINK1是一种线粒体丝氨酸/苏氨酸激酶,在线粒体吞噬(受损线粒体的选择性自噬清除)中起着关键作用。越来越多的证据表明线粒体功能障碍是PD发病的核心机制之一。因此,确定PINK1表达的调控机制可能会为PD提供新的治疗机会。虽然已经广泛研究了PINK1在线粒体损伤后的翻译后稳定作用,但对PINK1在转录或翻译水平上的调控机制知之甚少。

结果:在这里,我们证明了microRNA-27a(miR-27a)和miR-27b通过直接结合其mRNA的3'-非翻译区(3'UTR),在翻译水平上抑制PINK1的表达。重要的是,我们的数据表明,PINK1的翻译对于其在线粒体损伤时的积累至关重要。线粒体损伤后PINK1的积累受到miR-27a和miR-27b表达水平的强烈调节。miR-27a和miR-27b通过抑制PINK1的表达来防止线粒体吞噬内流,这可以通过减少受损线粒体中的泛素磷酸化、Parkin易位和LC3-II积累来证明,如受损线粒体向溶酶体的递送减少和线粒体标志物细胞色素c氧化酶2(COX2)的降解所示。此外,我们的数据表明,在慢性有丝分裂流下,miR-27a和miR-27b的表达显著诱导,这表明PINK1介导的有丝分裂与miR-27a-miR-27b+之间存在负反馈调节。

结论:我们证明miR-27a和miR-27b调节PINK1的表达和受损线粒体的自噬清除。我们的数据进一步支持了一种新的负调控机制,即miR-27a-miR-27bPINK1-介导的线粒体吞噬。因此,我们的结果大大提高了我们对PINK1表达和有丝分裂调节的理解,并表明miR-27a和miR-27b可能是PD的潜在治疗靶点。

关键词:线粒体;粉红色1;帕金森病;miR-27a;miR-27b。

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数字

图1
图1
miRNA对PINK1的调节。AGO-特异性RNA免疫沉淀分析示意图。bc(c) 粉红色1mRNA与miRNA/RISC复合物相关。HeLa细胞转染50 nM AGO2 siRNA或阴性对照。转染48小时后,用2A8抗AGO2抗体或非特异性IgG抗体从细胞裂解液中提取AGO2-结合mRNA。粉红色1然后通过qRT-PCR测量mRNA水平。抗AGO2的siRNA作为AGO-特异性RNA免疫沉淀分析的质量控制。粉红色1mRNA水平量化为组1的百分比(n个 = 6,双向方差分析)。d日e(电子)的击倒DICER1标准PINK1蛋白水平增加。HeLa细胞转染50 nMDICER1标准siRNA(DICER1 KD)或阴性对照(Ctl)。转染后48小时,收集细胞进行Western blot。箭头表示全长PINK1带,星号表示非特定带。将每个蛋白质水平归一化为相应的GAPDH水平,并量化为对照的百分比(n个 = 4,t吨-测试)。数值为平均值±SEM(n.s.=不重要**第页 < 0.01, ***第页 < 0.001)
图2
图2
miR-27a/b抑制人类PINK1的表达。人类3′UTR中miR-27a/b保守靶点示意图粉红色1mRNA。种子序列用红色表示。星号(*)表示保守核苷酸。b荧光素酶报告质粒示意图。报告构造包含人类全长3′UTR粉红色1下游具有野生型(WT)或突变(Mut)种子匹配位点的mRNA雷尼利亚荧光素酶基因。c(c)miR-27a/b的过度表达降低了HeLa细胞中的荧光素酶活性。用miR-27a/b或阴性对照(Ctl)转染细胞,并按指示转染报告体。转染后48小时,检测荧光素酶活性(n个 = 4,单向方差分析)。雷尼利亚荧光素酶活性标准化为相应的萤火虫荧光素酶活性。d日-miR-27a/b的过度表达降低了HeLa(D-E)和M17细胞(F-G)中PINK1蛋白的水平。用miR-27a/b或阴性对照(Ctl)转染细胞。转染后48小时,收集细胞进行Western blot(n个 = 4,t吨-测试)。PINK1蛋白水平归一化为相应的GAPDH水平,并量化为对照组的百分比。数据显示为控制百分比。数值为平均值±SEM(n.s.=不重要**第页 < 0.01, ***第页 < 0.001)
图3
图3
抑制内源性miR-27a/b功能可增加人类PINK1的表达。miR-27a/b和抗miR-27b/b序列比对示意图。星号(*)表示保守核苷酸。b抑制内源性miR-27a/b功能可增加HeLa细胞中的荧光素酶活性。用含有人的全长3′UTR的报告构建体转染细胞粉红色1下游野生型(WT)或突变型(Mut)种子匹配位点的mRNA雷尼利亚荧光素酶基因。转染后48小时,检测荧光素酶活性(n个 = 4,t吨-测试)。c(c)-(f)抑制内源性miR-27a/b可增加HeLa(C-D)和M17细胞(E-F)中PINK1蛋白的水平。用150 nM抗miR-27a/b或抗对照(抗-Ctl)转染细胞。转染后48小时,收集细胞进行Western blot。PINK1蛋白水平归一化为相应的GAPDH水平,并量化为对照组的百分比(n个 = 4,t吨-测试)。数据显示为控制百分比。数值为平均值±SEM(n.s.=不重要**第页 < 0.01, ***第页 < 0.00)
图4
图4
PINK1翻译对于线粒体损伤后PINK1的积累至关重要。 粉红色1线粒体损伤未改变mRNA水平。HeLa细胞与10μM CCCP或10μM寡霉素和4μM抗霉素联合培养2 h,然后,粉红色1用qRT-PCR测定mRNA水平。粉红色1mRNA水平被标准化为相应的GAPDH公司并量化为控制百分比(n个 = 8,t吨-测试)。bc(c)CCCP处理后PINK1的积累与翻译有关。HeLa细胞首先与100μM环己酰亚胺(CHX)预培养2 h,然后清洗。细胞与10μM CCCP(含或不含CHX)进一步孵育2小时(n个 = 4,双向方差分析)。数值为平均值±SEM(n.s.=不重要***第页 < 0.001)
图5
图5
miR-27a/b抑制线粒体损伤后PINK1的积累。bmiR-27a/b的过度表达抑制了线粒体损伤时PINK1的积累。转染后48 h,用10μM CCCP或10μM寡霉素和4μM抗霉素联合处理HeLa细胞2 h(n个 = 4,双向方差分析)。c(c)d日CCCP处理后,内源性miR-27a/b的抑制增加了PINK1的积累。(n个 = 4,双向方差分析)。将PINK1水平标准化为相应的GAPDH水平,并量化为对照的百分比。数值为平均值±SEM(n.s.=不重要*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001)
图6
图6
miR-27a/b防止pUb第65系列线粒体损伤后积累。bPINK1过度表达增加pUb第65系列仅当与CCCP孵育时,HeLa细胞中的积累。转染后48小时,细胞与10μM CCCP孵育2小时,pUb第65系列水平通过Western blot测定(n个 = 3,双向方差分析)。c(c)d日miR-27a/b的过度表达抑制了pUb第65系列CCCP在HeLa细胞中的积累(n个 = 4,双向方差分析)。e(电子)(f)抑制内源性miR-27a/b增加pUb第65系列CCCP在HeLa细胞中的积累(n个 = 4,双向方差分析)。将PINK1水平标准化为相应的GAPDH水平,并量化为对照的百分比。数值为平均值±SEM(n.s.=不重要**第页 < 0.01, ***第页 < 0.001)
图7
图7
miR-27a/b可防止Parkin在线粒体损伤后移位至线粒体。b转染后48 h,HeLa细胞与10μM CCCP孵育2 h。分离线粒体富集组分后,通过Western blot检测Parkin易位和LC3-II。将每个蛋白质水平归一化为相应的线粒体负荷控制(SOD2)水平,并量化为控制百分比(n个 = 3,双向方差分析)。通过监测p38细胞溶质和VDAC1线粒体标记评估线粒体部分的纯度。PN;核后,C;细胞质,M;线粒体(A)。c(c)d日转染48小时后,通过GFP、线粒体标记物(TOM20)抗体和核染料(Hoechst)观察到稳定表达GFP-Parkin的HeLa细胞。比例尺对应10μm。Parkin易位被量化为细胞质与核GFP信号的比率,所得比率被标准化为对照。数据收集自4个独立重复(n > 1000个细胞),并且显示为对照的百分比。数值为平均值±扫描电镜(*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001)
图8
图8
miR-27a/b通过溶酶体抑制线粒体损伤后的线粒体降解。bmiR-27a/b抑制受损线粒体向溶酶体的转运。转染48 h后,用CCCP或DMSO处理稳定表达mtKeima的HeLa细胞12 h。使用440/10 nm(中性)和548/20 nm(酸性)激发滤光片依次扫描细胞。比例尺对应100μm。酸性基团的信号强度除以中性基团的强度。数据是从12个独立的重复数据中收集的,以对照组(n > 300个细胞,双向方差分析)。c(c)d日miR-27a/b抑制线粒体损伤时COX2的降解。转染后48 h,用10μM CCCP或DMSO处理HeLa细胞16 h。通过Western blot监测线粒体内膜蛋白COX2的水平来评估受损线粒体的降解(n个 = 4、双向方差分析)。数值为平均值±SEM(n.s.=不重要*第页 < 0.05, ***第页 < 0.001)
图9
图9
在慢性有丝分裂流条件下,miR-27a/b水平升高。bHeLa细胞与二甲基亚砜、10μM CCCP或10μM寡霉素和4μM抗霉素的组合培养。miR-27a/b水平通过qRT-PCR测量并归一化为相应的U6型水平。数据显示为相对于DMSO控件的折叠变化。数值为平均值±扫描电镜(t吨-测试**第页 < 0.01, ***第页 < 0.001).c(c)miR-27a/b在有丝分裂中的作用。慢性有丝分裂流时,miR-27a/b水平升高,miR-28a/b作为负反馈回路,关闭过多的有丝分裂流量。在诱导miR-27a/b表达后,PINK1 mRNA的翻译被miR-27b/b抑制。因此,线粒体中PINK1-蛋白的水平降低,从而抑制溶酶体对受损线粒体的自噬降解(左侧面板). 相反,当miR-27a/b介导的PINK1抑制被低水平的miR-27b/b解除时,PINK1-翻译和受损线粒体的溶酶体清除增加(右侧面板)

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