Large intergenic non-coding RNA-ROR reverses gemcitabine-induced autophagy and apoptosis in breast cancer cells

doi:10.18632/oncotarget.10730

.2016年9月13日；7(37):59604-59617.

doi:10.18632/目标10730。

大的基因间非编码RNA-ROR逆转吉西他滨诱导的乳腺癌细胞自噬和凋亡

姚敏晨¹, 于柳¹, 海燕伟¹, 吕克珍¹, 裴芬福¹

附属公司

PMID： 27449099
预防性维修识别码：项目编号5312334
内政部： 10.18632/目标10730

大的基因间非编码RNA-ROR逆转吉西他滨诱导的乳腺癌细胞自噬和凋亡

姚敏晨等。 Oncotarget公司. 2016.

.2016年9月13日；7(37):59604-59617.

doi:10.18632/目标10730。

作者

陈耀敏¹, 于柳¹, 海燕伟¹, 吕克珍¹, 裴芬福¹

附属

¹浙江大学第一附属医院乳腺外科，杭州310000。

PMID： 27449099
预防性维修识别码：项目编号5312334
内政部： 10.18632/目标10730

摘要

本研究的目的是阐明长基因间非蛋白编码RNA、重编程调节因子（linc-ROR）在吉西他滨（Gem）诱导的乳腺癌细胞自噬和凋亡中的潜在作用。用短发夹RNA（shRNA）处理MDA-MB-231细胞，在Gem存在下敲低Linc-ROR表达。单用Gem治疗可降低细胞存活率，增加细胞凋亡和自噬。Gem处理也增加了LC3-II、Beclin 1、NOTCH1和Bcl-2的表达，但降低了p62和p53的表达。未经处理的MDA-MB-231细胞系强烈表达linc-ROR，但linc-ROR-敲除降低了细胞活力和p62和p53的表达，同时增加了细胞凋亡。Linc-ROR敲除还增加了LC3-II/β-actin、Beclin 1、NOTCH1和Bcl-2的表达，以及MDA-MB-231细胞中自噬小泡的数量。Linc-ROR通过抑制miR-34a启动子中组蛋白H3乙酰化负调控miR-34a的表达。我们得出结论，linc-ROR通过沉默miR-34a的表达来抑制Gem诱导的乳腺癌细胞自噬和凋亡。

关键词：乳腺癌；吉西他滨；大基因间非编码；线性ROR。

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没有。

数字

**图1。Gem治疗降低MDA-MB-231细胞的活性并诱导其凋亡**
细胞经Gem处理24h、48h和72h后，应用CCK8检测细胞活力。实验独立进行三次；杰姆，吉西他滨。

**图2。Gem治疗增加MDA-MB-231细胞自噬体和自噬相关蛋白的表达**
**答：。**MDA-MB-231细胞经Gem或阴性处理48h，再经50μmol/L MDC处理15min，倒置荧光显微镜观察细胞染色；B。MDA-MB-231细胞经Gem处理或阴性处理48h。使用TEM检查超微结构。白色箭头，典型的自溶体，具有双膜，在不同降解阶段含有细胞器；黑箭头，成熟的溶酶体；**首席执行官。**用0.05μmol/ml Gem处理MDA-MB-231细胞48小时。Western blot观察LC3-I（18KDa）和LC3-II（16KDa）的转化及p62、Beclin 1和NOTCH1的表达；**F、。**用EGFP-LC3血浆瞬时转染MDA-MB-231细胞，然后用0.05μmol/ml Gem处理48小时。共焦显微镜用于定位荧光。亮绿色斑点代表自噬体。计算了75个以上细胞中的LC3-II+亮绿色斑点。评估了对照组和其他治疗组之间的比较；*，*P（P）*< 0.05; **,*P（P）*< 0.01, ***,*P（P）*< 0.001

**图3。Gem诱导人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡**
**答：。**加入0.05μmol/ml Gem 48h后，流式细胞仪检测MDA-MB-231细胞凋亡率。细胞凋亡散点图及分析；B。蛋白质检测采用Western blot。**C、。**Bcl-2和p53的相对表达以平均值±SE表示。实验独立进行三次；*，*P（P）*< 0.05; 杰姆，吉西他滨。

**图4。通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）在MDA-MB-231和MCF10A细胞中表达Linc-ROR**

**图5。Linc-ROR影响Gem处理的MDA-MB-231细胞的细胞活力和凋亡**
**答：。** *线性ROR*qRT-PCR检测ROR-shRNA转染MDA-MB-231细胞的表达；B。CCK8法检测细胞活力；**C、。**流式细胞术检测细胞凋亡率；qRT-PCR，定量逆转录聚合酶链反应；*，*P（P）*< 0.05; 杰姆，吉西他滨。

**图6。Linc-ROR影响Gem处理的MDA-MB-231细胞凋亡和自噬相关蛋白的表达**
**答：。**蛋白质的Western blot检测；B。使用蛋白质印迹在MDA-MB-23细胞中Lc3-I（18KDa）和Lc3-II（16KDa）之间的转化；**C、。**使用Western blot检测Gem处理的MDA-MB-231细胞中凋亡和自噬相关蛋白的表达；*，*P（P）*< 0.05.

**图7。Linc-ROR影响Gem处理的MDA-MB-231细胞自噬体组装**
**答：。**倒置荧光显微镜观察MDA-MB-231细胞的染色；B。透射电镜观察MDA-MB-231细胞的超微结构。白色箭头，典型的自溶体，具有双膜，在不同降解阶段含有细胞器；黑色箭头，成熟溶酶体；杰姆，吉西他滨。

图8。Linc-ROR负调节*miR-34a基因*
**答：。**Notch1 3′UTR的野生型和突变报告子结构；B。linc-ROR与miR-34a结合位点的分析；**C、。**用RT-PCR检测linc-ROR的表达；D。蛋白质的Western blot检测；**E.公司。**Western blot检测MDA-MB-23细胞中Lc3-I（18KDa）和Lc3-II（16KDa）的转化；**F、。**Western blot检测凋亡和自噬相关蛋白的表达，*P（P）*< 0.05; RT-PCR，逆转录聚合酶链反应。

**图9。组蛋白H3在*miR-34a基因*Gem-treated组和sh-ROR+Gem组中的启动子**
吉西他滨；*，*P（P）*< 0.05.

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