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.2016年7月22日：7:12277。
doi:10.1038/ncomms12277。

利用光学可逆蛋白-蛋白质相互作用模块进行外显子工程以实现可溶性蛋白质的高效胞内递送

尹南斌（Nambin Yim） 1, Seung-Wook Ryu先生 2, Kyungsun Choi先生 三, Kwang Ryeol Lee先生 2, Seunghee Lee（李承熙） 1, Hojun Choi先生 1, Jeongjin Kim公司 4, 穆罕默德·沙克尔 5, Woong Sun公司 5, 济和公园 1, Daesoo Kim公司 4, Won Do Heo公司 4 6 7, Chulhee Choi先生 8 9 10
附属公司

利用光学可逆蛋白-蛋白质相互作用模块进行外显子工程以实现可溶性蛋白质的高效胞内递送

尹南斌（Nambin Yim）等。 国家公社. .

摘要

纳米粒子介导的功能性大分子递送是治疗多种人类疾病的一种很有前景的方法。在纳米颗粒中，细胞源性外泌体最近被强调为体内输送核苷酸和化学药物的一种新的治疗策略。在这里，我们描述了一种用于靶蛋白细胞内传递的新工具，称为“通过光学可逆蛋白质-蛋白质相互作用进行蛋白质装载的外显体”（EXPLORs）。通过将蓝光控制的可逆蛋白-蛋白质相互作用模块与外显体生物发生的内源性过程相结合，我们能够成功地将货物蛋白装载到新生成的外显体中。用蛋白载EXPLORs治疗表明，在体内外显著增加了细胞内货物蛋白的水平及其在受体细胞中的功能。这些结果清楚地表明了EXPLORs作为蛋白治疗药物有效细胞内转移到受体细胞和组织的机制的潜力。

PubMed免责声明

利益冲突声明

C.C.是Cellex Life Sciences Inc.的科学创始人兼首席执行官。S.-W.R.和K.R.L.是Celles Life Scences Inc.的员工。KAIST已根据这些结果提交了专利申请。其余的作者声明没有相互竞争的经济利益。

数字

图1
图1。工程EXPLOR的生成。
(一)用于生产EXPLOR的DNA结构示意图。(b条)显示融合蛋白及其拟议作用的示意图。(c（c）)瞬时转染HEK293T细胞CIBN-EGFP-CD9和m樱桃-CRY2表达载体。在488-nm激光刺激前后对mCherry荧光进行成像（15 持续时间为350秒 微瓦 厘米−2). 比例尺，20 微米（5 μm用于插入图像）。至少10个实验的代表性结果。(d日)瞬时转染HEK293T细胞CIBN-EGFP-CD9和m樱桃-CRY2对不同时间段（0–12）的mCherry荧光进行延时成像 min）在488-nm光（15）刺激（黑色箭头）后 持续时间为350秒 微瓦 厘米−2). 比例尺，5 微米。至少10个实验的代表性结果。(e（电子）)细胞质和质膜中mCherry荧光的定量。数据以平均值±标准误差表示(n个=3).
图2
图2。EXPLORs中靶蛋白的光依赖性负载。
(一)瞬时转染细胞CIBN-EGFP-CD9和m樱桃-CRY2表达载体在不同功率的蓝光照射下保持48 h.使用抗mCherry、EGFP和CD63（一种外显体标记物）的抗体对细胞衍生外显体进行免疫印迹分析。三个独立实验的代表性结果。(b条)该图显示了三个独立实验中mCherry-CRY2蛋白相对于CIBN-EGFP-CD9蛋白的归一化量的密度分析。数据以平均值±标准误差表示(n个=3）和Tukey's事后（post-hoc）测试用于显著的群体效应(**P（P）<0.01, ***P（P）<0.001）通过方差分析确定。
图3
图3。不同蛋白质装载方法之间靶蛋白外体装载能力的比较。
(一)瞬时转染HEK293T细胞荧光素酶-樱桃-CRY2仅表达载体，XPack-luciferase-mCherry酶表达载体或联合转染CIBN-EGFP-CD9和荧光素酶-樱桃-CRY2表达载体。24天后 h、 细胞通过荧光显微镜成像，以获得mCherry融合蛋白的表达谱。五个独立实验的代表性结果。比例尺，20 微米。(b条)樱桃荧光定量。数据以平均值±标准误差表示(n个=5）和Tukey's事后（post-hoc）通过方差分析（ANOVA）对显著的群体效应进行检验。对照组：未转染的HEK293T细胞；OVER：瞬时转染有荧光素酶-樱桃-CRY2矢量；XP：转染有XPACK萤光素酶mCherry矢量；和EXPLOR：用两者转染的细胞荧光素酶-樱桃-CRY2和CIBN-EGFP-CD9向量。(c（c）)用不同载体瞬时转染的细胞保持48个 h.在防爆电池的情况下，电池保持在没有（OFF）或有（ON）蓝光照明的状态；5 × 108对分离的外泌体颗粒进行荧光素酶活性分析。数据以平均值±标准误差表示(n个=3）和Tukey's事后（post-hoc）测试用于显著的群体效应(**P（P）<0.01, ***P（P）<0.001）通过方差分析确定。(d日)通过将外显体中的荧光素酶分子数除以外显体产生细胞中的荧光素酶分子数来计算各种蛋白负载外显体的负载效率。使用重组荧光素酶从标准曲线估计荧光素素酶分子的数量。数据以平均值±标准误差表示(n个=3）和Tukey's事后（post-hoc）测试用于显著的群体效应(***P（P）<0.001）通过方差分析确定。NS，不显著。
图4
图4。EXPLOR介导的货物蛋白的细胞内递送。
(一,b条)HeLa细胞在没有或存在5×10的条件下培养924种孤立外泌体的颗粒 h和荧光显微镜成像。用两种成像处理工具ImageJ和Cellprofiler定量mCherry的荧光强度。数据以平均值±标准误差表示(n个=15）和Tukey's事后（post-hoc）测试用于显著的群体效应(***P（P）<0.001）通过方差分析（ANOVA）确定。比例尺，100 微米。(c（c）,d日)HeLa细胞在不存在或存在0.1 毫克 毫升−1mCherry:EXPLORs或Bax-mCherry：12人的EXPLORs h、 用4%多聚甲醛固定。然后是细胞色素c（c）用与Alexa Fluor 647结合的抗体染色，并通过共焦显微镜成像。细胞色素比率c（c）通过细胞计数分析定位。数据以平均值±s.e.m表示(n个=3）和Tukey’s事后（post-hoc）测试用于显著的群体效应(**P（P）<0.01）。比例尺，20 微米。(e（电子）)HeLa细胞在不存在或存在0.1 毫克 毫升−1mCherry:EXPLORs或srIκB:12的EXPLORs h、 用10个 纳克 毫升−1肿瘤坏死因子-α（TNF-α）增加30 min，用4%多聚甲醛固定。NF-κB p65用与Alexa Fluor 488结合的抗体染色，并通过共焦显微镜成像。(如果)细胞核提取物检测p65/c-Rel（NF-κB）的DNA结合活性。数据以平均值±标准误差表示(n个=3）和Tukey's事后（post-hoc）测试用于显著的群体效应(**P（P）<0.01）。比例尺，20 微米。NS，不显著。
图5
图5。勘探介导的Cre重组酶递送在体外和体内.
(一,b条)分化的神经球衍生细胞在没有或存在2×10的条件下培养10每毫升Cre:EXPLORs（0.16 毫克 毫升−1)或转染pCMV-Cre病毒72的矢量 h.用4%多聚甲醛固定细胞，并用针对神经元特异性III类β-微管蛋白标记物Tuj1、GFP和Hoechst 33342的抗体进行免疫染色。通过细胞计数分析EGFP表达细胞的比率。数据以平均值±标准误差表示(n个=10个字段）和Tukey的事后（post-hoc）该检验用于方差分析确定的显著组效应。比例尺，100 微米。(c（c）)Cre:EXPLORs管理的实验方案loxp-stop-lexp-eNpHR3.0-EYFP转基因小鼠。总计50 μl Cre:EXPLORs（10 毫克 毫升−1)被给予pCAG-loxP-STOP-loxP-eNpHR3.0-EYFP型腹外侧注射转基因小鼠。(d日)用4%甲醛固定EXPLOR注射转基因小鼠的脑片，并用荧光显微镜进行成像。绿色荧光表示eNpHR3.0-EYFP蛋白表达，蓝色荧光表示细胞核。插入图像显示了在EXPLOR给药的小鼠incerta（ZI）区神经元中详细的细胞eNpHR3.0-EYFP表达的共焦显微镜图像。比例尺，500 μm（50 μm用于插入共焦图像）。髋，海马；Th，丘脑。两个独立实验的代表。(e（电子）)脑NeuN/GFAP免疫组化的代表性图像。粉红色神经元特异性核蛋白（NeuN）阳性神经元；红色胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性星形胶质细胞。物镜，×40。比例尺，20 微米。NS，不显著。
图6
图6。EXPLOR技术示意图。
在EXPLOR诱导的供体细胞中，CRY2蛋白融合到一个货运蛋白，CIBN与一个典型的外泌体标记CD9蛋白偶联。蓝光照射诱导CIBN和CRY2融合蛋白之间的可逆PPI。在持续的蓝光照射下，货物蛋白质被引导到细胞膜的内表面或早期内体的表面。成熟的多泡体（MVB）通过膜与质膜融合，从细胞中容易分泌携带货物蛋白的外泌体（EXPLORs）。胞吐后，EXPLORs很容易被分离和纯化在体外纯化的EXPLORs可用于通过膜融合或内吞过程将货物蛋白输送至靶细胞。底部灰色方框突出显示了从EXPLORs生物生成到靶细胞递送的关键步骤。
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