跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2016年9月9日；291(37):19245-56.
doi:10.1074/jbc。M116.740266。 Epub 2016年7月19日。

内皮排斥素诱发的自噬与血管扩张

戈亚尔 1, 玛丽亚·古比奥蒂 1, 达芙尼·R·奇瑞 2, 林翰（Lin Han） 2, 雷纳托·维奥佐 三
附属公司

内皮排斥素诱发的自噬与血管扩张

戈亚尔等。 生物化学杂志. .

摘要

内皮排斥素是珍珠糖的C末端结构域，是一种血管抑制分子，通过其与VEGFR2的相互作用，充当自噬的有效诱导剂。在本研究中，我们使用原子力显微镜检查了内啡肽对内皮细胞的影响。可溶性内啡肽引起形态和生物物理变化，如细胞表面粗糙度和细胞高度增加。令人惊讶的是，这些变化并没有伴随内皮细胞弹性模量的变化。我们发现内啡肽诱导的自噬通量导致哺乳动物雷帕霉素靶点与LC3阳性自噬体共存。内啡肽在AMP活化激酶α的上游发挥作用，作为化合物C（AMP活化的激酶α的抑制剂），消除内啡肽介导的Beclin 1和LC3的活化和共定位，从而减少自噬进展。在功能上，我们发现内啡肽和Torin 1（一种典型的自噬诱导剂）均能抑制体外血管生成。我们的结论是，自噬是一种新的机制，内啡肽通过这种机制促进不依赖于营养剥夺的血管抑制。

关键词：AMP-活化激酶（AMPK）；贝克林-1（BECN1）；血管生成；原子力显微镜（AFM）；珍珠糖；蛋白多糖。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
内皮排斥素诱导过度表达VEGFR2的猪内皮细胞发生纳米级分子变化。 A–F，经载体内啡肽（200 n）处理的PAER2细胞的代表性AFM图像米，6小时）和Torin 1（20牛顿米，2小时）。对每种条件进行三个独立的实验，也作为生物复制品，至少分析5个细胞/条件/实验（技术复制品）。这个白色箭头指示分子碰撞。A–C，整个细胞的三维图像。D–F型，放大细胞的二维图像（40μm）。这个棕色刻度颜色图中显示了不同的高度光和深色分别对应于较高和较低的地形（参见相关比例尺）。G–I型，线扫描轮廓蓝色和红线在中显示的放大图像中D–F型.
图2。
图2。
人脐静脉内皮细胞在内啡肽治疗后表现出生物物理变化。 A–C，用载体处理的HUVEC的代表性AFM图像。E–G公司，经内啡肽（200 n）处理的HUVEC的代表性AFM图像米，6小时）。A类和E类和B类和F类细胞的完整和放大三维图像。C类和G公司，二维放大图像。天和H（H），线扫描轮廓蓝色和红线在中显示的放大图像中C类和G.I–K公司，HUVEC的低倍AFM图像，表示使用载体内啡肽（200 n）进行治疗米，6小时）和Torin 1（20牛顿米，2小时）。注意，内啡肽和Torin 1处理的细胞中离散升高点增加，如白色圆形区域这些点被假设为自噬体。L（左），中图像中每个细胞自噬体样结构数量的量化I–K公司。M（M），表面粗糙度参数Ra，作为HUVEC中内啡肽或Torin 1处理的函数。对于量化：车辆来自三个独立实验获得的三个生物复制品的72个细胞；内皮排斥素，来自三个独立实验获得的三个生物复制品的50个细胞；托林1，来自三个独立实验获得的三个生物复制品的48个细胞。*，第页< 0.05; ***,第页< 0.001; 学生的t吨测试。
图3。
图3。
内皮排斥素和自噬不会显著改变内皮细胞的弹性模量。 A–D用溶媒、内啡肽或HBSS处理的HUVEC的微分干涉对比显微镜图像。注意自噬体样结构的存在，如白色箭头在内啡肽和HBSS处理的细胞中。E类，测量在以下条件下处理的HUVEC的弹性模量A–D通过AFM纳米压痕测定。对于量化：车辆,n个=从六个独立实验获得的六个生物复制品中获得103个技术复制品，内皮排斥素，200牛顿米内啡肽6小时，n个=从八个独立实验获得的八个生物复制品中获得126个技术复制品；HBSS，4小时，n个=从四个独立实验获得的四个生物重复中获得71个技术重复。这个第页使用Student的t吨测试。
图4。
图4。
内皮排斥素诱导自噬通量，并将mTOR动员到LC3阳性自噬体中。 A类在无氯喹和有氯喹的情况下，内啡肽治疗后HUVEC裂解物的代表性免疫印迹。B类，使用从六个独立实验中获得的六个生物样品中的每一个的一个技术复制品对LC3-II进行量化，如A类，标准化为GAPDH。C–E类用载体内啡肽（200 n）治疗后，HUVEC中mTOR和LC3染色米，6 h）或Torin 1（20 n米，2小时）。比例尺=10微米。这个白色箭头指示自噬体。F类，量化用载体处理的HUVEC中每个细胞的自噬体数量（LC3-和mTOR-阳性）(n个=来自三个单独实验获得的三个生物复制品的76个细胞），内啡肽(n个=从三个单独的实验中获得的三个生物复制品中的49个细胞），或Torin 1(n个=从三个单独的实验中获得的三个生物复制品中的60个细胞）。*，第页<0.05，学生的t吨测试。
图5。
图5。
内源性排斥素通过AMPKα磷酸化激活自噬途径。 A类，P-AMPKα（Thr）的代表性免疫印迹172)对内啡肽（200n）的反应米)在不同的时间点。B类，P-AMPKα的定量：AMPKA类统计分析采用单因素方差分析。C类与内啡肽（200 n）孵育后，P-AMPKα、AMPK总α、Beclin 1和LC3-II的代表性免疫印迹米，6 h），化合物C（30μ米，30 min预处理+6 h），或内啡肽和化合物C。天，P-AMPKα：AMPKC.E公司和F类，Beclin 1和LC3-II的定量，如C类在GAPDH标准化后。使用三个独立实验获得的三个生物复制品中的一个技术复制品进行量化。D–F型, *,第页<0.05，学生的t吨测试。
图6。
图6。
AMPKα和VEGFR2是内皮素介导的HUVEC自噬所必需的。 A–D，描绘Beclin 1共同定位的免疫荧光图像(绿色)和LC3-II(红色)用车辆治疗后显示(n个=来自三个独立实验获得的三个生物复制品的31个细胞），200 n米内啡肽6小时(n个=从三个独立实验中获得的三个生物复制品中的36个细胞），30μ米化合物C预处理30分钟+6小时(n个=来自三个独立实验获得的三个生物复制品的28个细胞），或化合物C+内啡肽(n个=HUVEC中三个独立实验获得的三个生物复制品中的28个细胞。细胞核用DAPI染色(蓝色).比例尺=10μm。白色箭头表示自噬体。E类，量化根据中所示条件处理的HUVEC中每个细胞的自噬体数量A–D。F类，用干扰siRNA预处理的HUVEC的代表性免疫印迹(SiScr公司)或siRNA靶向VEGFR2(siVEGFR2)用内啡肽（200n）治疗后米，6小时）。G–H（G–H）、将VEGFR2归一化为GAPDH（从三个独立实验获得的三个生物复制品中的每一个获得一个技术复制品）和P-AMPKα：AMPKβ比率（从三项独立实验获得三个生物重复品中的每个获得一个技术复制品）后的量化，如所示F类. *,第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001; 学生的t吨测试。
图7。
图7。
内皮排斥素和Torin 1抑制血管生成体外在小鼠主动脉环试验中。 A–D，光学显微镜图像描述了载体处理和内啡肽处理环（200 n）之间微血管生长的差异米).B类和天，中芽的特写视图A类和C、E、H，车用和内啡肽处理环（200 n）的共焦图像米)细胞核用DAPI染色(蓝色)内皮细胞用CD31染色(红色).F类和H（H），中发现的芽的特写视图E类和G.I–L公司，用载体或Torin 1处理的环的代表性共焦图像（40 n米). 芽苗用BS-1凝集素染色(红色)，细胞核用DAPI染色(蓝色).K（K）和L（左），放大视图我和J·M，量化载体、内啡肽和Torin 1处理环中的芽数。第一载体组的四个独立实验中有16个技术复制品和四个生物复制品，内啡肽组的四项独立实验中也有18个技术复制物和四个生物学复制品，第二载体组的三项独立实验也有11个技术复制体和三个生物复制体，Torin 1组的三个独立实验中的12个技术复制和三个生物复制。比例尺=100μm.**，第页< 0.01; 学生的t吨测试。
图8。
图8。
化合物C抑制自噬可逆转内啡肽诱导的血管抑制。 A–D，使用载具治疗主动脉环的代表性图像，200 n米内皮素，1μ米化合物C或内啡肽和化合物C。血管由白色箭头.注意以下两种情况下可见芽的差异B类和D.E公司，每个治疗组每环血管数的量化。载体组的6个独立实验中有14个技术复制品和6个生物复制品，内啡肽组的4个独立实验有9个技术复制物和4个生物复制物，化合物C组的4项独立实验有8个技术复制体和4个生物学复制品，以及化合物C和内啡肽组的四个独立实验中的10个技术复制品和四个生物复制品。比例尺=100μm.*，第页< 0.05; 学生的t吨测试。
图9。
图9。
描述内啡肽与VEGFR2的相互作用以及随后的下游信号事件的工作模型。最终结果是同时抑制血管生成并诱导长期自噬。通过抑制VEGFR2或阻断AMPK酶活性可以有效阻止这两种事件。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Iozzo R.V.（2005）基底膜蛋白聚糖：从地窖到天花板。自然修订版分子细胞生物学。6, 646–656-公共医学
    1. Iozzo R.V.和Schaefer L.（2015）《蛋白聚糖的形式和功能：蛋白聚糖的综合命名》。基质生物。42, 11–55-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Farach-Carson M.C.、Warren C.R.、Harrington D.A.和Carson D.D.（2014）《边境巡逻：珍珠糖/硫酸乙酰肝素蛋白聚糖2在细胞和组织边界的独特作用》。基质生物。34, 64–79-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Noonan D.M.、Fulle A.、Valente P.、Cai S.、Horigan E.、Sasaki M.、Yamada Y.和Hassell J.R.（1991）珍珠糖（一种基底膜硫酸乙酰肝素蛋白聚糖）的完整序列显示出与层粘连蛋白A链、低密度脂蛋白受体和神经细胞粘附分子的广泛相似性。生物学杂志。化学。266, 22939–22947-公共医学
    1. Murdoch A.D.、Dodge G.R.、Cohen I.、Tuan R.S.和Iozzo R.V.（1992）来自基底膜的人硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG2/perlecan）的一级结构：具有与低密度脂蛋白受体、层粘连蛋白、神经细胞粘附分子和表皮生长因子同源的多个结构域的嵌合分子。生物学杂志。化学。267, 8544–8557-公共医学