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。2016年10月；157(10):3749-3759.
doi:10.1210/en.2016-1418。 Epub 2016年7月18日。

基于5-氟尿嘧啶的小鼠骨髓下清髓模型研究骨髓源性细胞在生殖过程中的贩运

雷谢夫·塔尔 1, 刘莹（音） 1, 尼古拉·普卢奇诺 1, 沙菲克·谢赫 1, 拉马奈亚·马米拉帕利 1, 休·S·泰勒 1
附属公司

基于5-氟尿嘧啶的小鼠骨髓下清髓模型研究骨髓源性细胞在生殖过程中的贩运

雷谢夫·塔尔等。 内分泌学。 2016年10月。

摘要

骨髓（BM）衍生细胞（BMDCs）有助于子宫内膜再生。我们的目的是建立一种使用5-氟尿嘧啶（5-FU）的非性腺病毒毒性小鼠骨髓移植（BMT）模型，用于研究骨髓间充质干细胞在生殖过程中的贩运。雌性C57BL/6J小鼠接受单剂量（CTX-1）或配对（CTX-2）5-FU（150 mg/kg），或单剂量（CTX-1+SCF）或配对剂量（CTX-3+SCF）带干细胞因子（SCF）的5-FU。对照组小鼠只接受BMT或生理盐水。BM细胞（20×106)对转基因绿色荧光蛋白（GFP）小鼠进行静脉注射。为了进行生育试验，小鼠在BMT后第28天进行交配。或者，在BMT和BMDCs向子宫募集后1个月处死小鼠。接受5-FU±SCF的小鼠表现出完整的卵巢功能和生育能力。CTX-3+SCF在1个月时导致最大的骨髓供体嵌合体（～45%）。流式细胞术分析表明，CTX-3+SCF小鼠子宫总细胞中有6.6%为GFP+BMDCs。值得注意的是，在CTX-1或仅BMT小鼠的子宫中，这大约是BMDC的40倍和80倍（分别为6.6%和0.16%和0.08%，P<0.001）。免疫组织化学分析显示，子宫内BMDC主要定位于子宫内膜间质（71.8%）。大多数子宫内膜BMDCs与泛红细胞CD45标记物共定位（58.5%），但41.5%为CD45阴性。细胞角蛋白和CD31染色显示GFP+CD45-细胞不是上皮细胞或内皮细胞，证实了它们的基质特性。我们证明，双剂量5-FU方案可在维持卵巢功能和生育能力的同时，有效地实现BM供体嵌合。该模型可用于研究各种生殖生理和病理条件下骨髓间充质干细胞向子宫的转运。

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数字

图1
图1
各种基于5-FU的骨髓清除术方案的毒性。A、 描述BM调节所用不同方案的示意图。小鼠在BMT前−6和−1天接受PBS或5-FU ip注射。此外，在5-FU给药前21和9小时以及给药后3小时分别通过3次50μg/kg ip注射给予SCF。B、 与CTX-1、BMT和PBS对照组相比，不同BM调节组的体重随时间的百分比变化表明CTX-2组的体重显著下降。C、 CTX-3+SCF、CTX-1+SCF和PBS对照组的体重随时间变化的百分比。D、 Kaplan-Meier生存曲线显示，与所有其他组相比，CTX-2小鼠的生存率降低；CTX-2组n=29，所有其他组n=14。数据表示为平均值±SEM；*，P（P）<.01和**，P（P）=.005（CTX-2组与所有其他组）。
图2
图2
供体嵌合的流式细胞术分析。A、 BMT后第28天外周血细胞流式细胞术分析的代表性图像显示了不同BM调节方案中循环中GFP阳性细胞的百分比。B、 骨髓移植后第7、14、21和28天的平均%GFP阳性循环细胞；每组n＝6只小鼠。图表中的数据表示为平均值±SEM；*，P（P）CT-3+SCF组与所有其他组相比<0.05；+，P（P）CTX-1+SCF和CTX-3+SCF组与CTX-1和CTX-2组的差异分别为<0.01(P（P）<.05）。
图3
图3
各种基于5-氟尿嘧啶的骨髓清除术方案对小鼠生育能力的影响。BMT.a，妊娠率，BMT.a后21天恢复后，将小鼠与产前雄性交配。B、 植入部位的平均数量。C、 活胎平均数。D、 小鼠平均妊娠吸收率；n=12-14只/组。数据以平均值±SEM或百分比表示（视情况而定）。*，P（P）与所有其他组相比<0.05。
图4
图4
BMT后1个月，BMDCs募集到子宫。A和B，子宫总细胞流式细胞术的代表性图像（A）和图形（B），显示CTX-3+SCF、CTX-1、BMT和PBS组子宫中发现的GFP阳性BMDCs的百分比；n=每组6-8只小鼠。数据以平均百分比±SEM表示；*，P（P）=.001与所有其他组比较。C、 使用抗GFP抗体（棕色）对子宫切片进行免疫染色，显示CTX-3-SCF处理的小鼠子宫中GFP阳性BMDC的丰度。插入是虚线矩形的更高放大倍数。比例尺，100μm。
图5
图5
骨髓移植后1个月，骨髓间充质干细胞在子宫中产生基质细胞，但不产生内皮细胞或上皮细胞。A–D，子宫组织切片的荧光共焦显微镜分析。用抗GFP抗体（绿色）对PBS对照组（A）或CTX-3+SCF小鼠（B–D）的子宫组织进行染色，并与抗CD45（泛白细胞标记物）抗体（红色）（A和B）、CD31（内皮标记物）血清（红）（C）或细胞角蛋白（上皮标记物）抗抗体（红）共同染色（D）。细胞核经DAPI染色，显示为蓝色。插图是剖面内区域的更高放大率。白色箭头指向BM衍生白细胞（GFP-阳性/CD45阳性）。白色箭头指向非白细胞BMDC（GFP-阳性/CD45阴性），它们也没有与CD31（C）或细胞角蛋白（D）标记物共定位，表明它们的基质特性。比例尺，50μm。
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