SQSTM1/p62 mediates crosstalk between autophagy and the UPS in DNA repair

doi:10.1080/15548627.2016.1210368

.2016年10月2日；12(10):1917-1930.

doi:10.1080/15548627.2016.1210368。 Epub 2016年7月8日。

SQSTM1/p62介导DNA修复中自噬和UPS之间的串扰

附属公司

¹英国泰恩河畔纽卡斯尔大学细胞和分子生物科学研究所。
²c美国纽约州罗切斯特市罗切斯特大学生物系。
^三b英国剑桥大学剑桥医学研究所。
⁴d挪威特罗姆瑟大学医学生物学系分子癌症研究小组-挪威特罗姆索北极大学。

PMID： 27391408
预防性维修识别码：项目编号5391493
内政部： 10.1080/15548627.2016.1210368

SQSTM1/p62介导DNA修复中自噬和UPS之间的串扰

格雷姆·休伊特等。自噬. 2016.

.2016年10月2日；12(10):1917-1930.

doi:10.1080/15548627.2016.1210368。 Epub 2016年7月8日。

附属公司

¹英国泰恩河畔纽卡斯尔大学细胞和分子生物科学研究所。
²c美国纽约州罗切斯特市罗切斯特大学生物系。
^三b英国剑桥大学剑桥医学研究所。
⁴d挪威特罗姆瑟大学医学生物学系分子癌症研究小组-挪威特罗姆索北极大学。

PMID： 27391408
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摘要

SQSTM1/p62（隔离体1）选择性地靶向多泛素化蛋白质，通过大自噬和蛋白酶体进行降解。此外，SQSTM1在细胞质和核室之间穿梭，尽管其在细胞核中的作用相对未知。在这里，我们报告了SQSTM1与DNA损伤灶（DDF）动态关联并调节DNA修复。在DNA损伤诱导后，SQSTM1与FLNA（丝线蛋白A）相互作用，FLNA先前已被证明可招募DNA修复蛋白RAD51（RAD51重组酶）来进行双链断裂并促进同源重组（HR）。SQSTM1促进细胞核内FLNA和RAD51的蛋白酶体降解，导致细胞核RAD51水平降低和DNA修复减慢。SQSTM1通过促进非同源末端连接（NHEJ）而牺牲前者来调节HR和NHEJ之间的比率。这种SQSTM1依赖机制介导了大自噬对DNA修复的影响。此外，随着年龄的增长，SQSTM1的核定位及其与DDF的关联性增加，并被终身饮食限制所阻止，这表明此处确定的机制失衡可能会导致衰老和年龄相关疾病。

关键词：DNA损伤；SQSTM1；老化；自噬；同源重组；非同源端接。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
核SQSTM1与DDF共存。（A-D）如图所示，在缺乏或存在钩体霉素B（Lepto B）的情况下，对照射0和5小时的人成纤维细胞（MRC5）中SQSTM1和TP53BP1的共定位进行了分析。代表性图像如（A）所示，并量化了SQSTM1（B）、TP53BP1（C）和SQSTM1-TP53BP1共定位（D）病灶的平均数量。（E）年轻（3米-岁）和老年（24个月）C57BL/6野生型小鼠肝细胞的代表性图像随意（AL）饮食。用SQSTM1和γH2AFX抗体对切片进行免疫染色。在AL或饮食限制（DR）饮食的小鼠肝细胞切片中定量SQSTM1（F）、γH2AFX（G）和SQSTM-γH2AFX共定位（D）病灶的平均数量。比例尺：10µm；n=3；误差条代表SEM；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。

**图2。**
SQSTM1抑制TP53BP1-阳性DDF的分辨率。γH2AFX病灶平均数量的代表性图像（A）和量化（B）*平方毫米1*^−/−和*平方米1*^+/+1 Gy X射线照射后5分钟和300分钟的非红外MEF。（C-D）*平方毫米1*^−/−和*平方米1*^+/+将稳定表达mCherry-TP53BP1的MEF暴露于0.25Gy X射线照射下，并通过活细胞成像监测TP53BP1300分钟的病灶动力学。代表性图像如（C）所示，细胞核以白色虚线边界标记。（D） Kaplan-Meier图显示了单个TP53BP1病灶在*平方毫米1*^−/−和*平方米1*^+/+辐照后的MEF。请注意，0.25 Gy用于诱导DDF的低频率，并有助于准确追踪体内病灶。Gehan-Breslow试验p<0.01。（E）内源性TP53BP1病灶平均数的量化*平方毫米1*^−/−和*平方米1*^+/+1Gy X射线照射后0-480分钟的MEF。（F）内源性TP53BP1病灶平均数的量化*平方毫米1*^−/−和*平方米1*^+/+用依托泊苷（Etop）诱导DNA损伤120分钟后的MEF，随后有或没有300分钟的恢复期（在没有依托泊甙的情况下）。（G）照射后300分钟TP53BP1病灶平均数量的量化*平方毫米1*^−/−和*平方米1*^+/+用对照（GFP）或GFP-SQSTM1质粒转染MEF过夜。（H）*平方米1*^+/+MEF、，*平方毫米1*^−/−MEF，以及*平方毫米1*^−/−过度表达FLAG-SQSTM1的MEF用足叶乙甙治疗120分钟，无论是否有300分钟的恢复期。样品受到中性彗星的影响，尾巴强度百分比被量化。（一） SQSTM1构造的域结构示意图。标记了关键结构域：UBA，泛素相关域；PB1、Phox和Bem1p结构域；ZnF，ZZ型锌指畴；NES，核出口信号；NLS1/2，核定位信号。（J） TP53BP1病灶平均数的量化*平方毫米1*^−/−照射300分钟后，MEF过度表达GFP标记的SQSTM1突变体。比例尺：10µm。n=3；误差条代表SEM；NS，不显著；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。

**图3。**
SQSTM1介导自噬对DNA修复的影响。TP53BP1病灶平均数的代表性图像（A）和量化（B）*Atg5型*^+/+和*第5天*^−/−MEF辐照后0-480分钟。（C）显示加扰控制（Sc）和*平方米1*siRNA输入*Atg5型*^+/+和*第5天*^−/−中小微企业。（D）内源性TP53BP1病灶平均数的量化*Atg5型*^+/+和*第5天*^−/−用对照或*平方米1*siRNA 5和照射后300分钟。（E）内源性TP53BP1病灶平均数的量化*平方米1*^+/+和*平方毫米1*^−/−用或不用巴非霉素A处理的MEF₁（Baf）照射后5分钟和300分钟。比例尺：10µm；n=3；误差条代表SEM；NS，不显著；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。

**图4。**
FLNA和RAD51的SQSTM1依赖性蛋白酶体降解调节DNA修复。（A）*平方毫米1*^−/−MEF，稳定表达FLAG-SQSTM1(*平方毫米1*^−/−+在指示位置辐照FLAG-SQSTM1），60分钟后对核馏分进行反FLAG IP。免疫印迹法检测FLAG-SQSTM1与内源性FLNA和RAD51的相互作用。（B）对转染GFP-FLNA的HeLa细胞进行辐照，60分钟后对核组分进行抗GFP-IP。免疫印迹法检测GFP-FLNA与内源性SQSTM1和RAD51的相互作用。（C-D）*平方毫米1*^−/−和*平方米1*^−/−+对FLAG-SQSTM1 MEF进行辐照，并在指定的时间点进行细胞分馏。分析核（C）和细胞质（D）组分的FLNA、RAD51、SSQTM1和LMNB1作为负荷控制。可在图S4B-C（E-G）中找到斑点的量化*平方毫米1*^−/−和*平方毫米1*^−/−+如有指示，将FLAG-SQSTM1 MEF与MG132或钩端霉素B（Lepto B）预先孵育3 h。用1 Gy X射线照射细胞，并在MG132或钩体霉素B存在下再培养60分钟。分析核组分的FLNA（（E）和F）以及RAD51（（E和G）水平，并相对于LMNB1进行量化。n=3；误差条代表SEM；NS，不显著；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。

**图5。**
SQSTM1对DNA修复的FLNA依赖性作用。（A）具有代表性的污点弗纳siRNA输入*平方毫米1*^−/−和*平方毫米1*^−/−+标志SQSTM1 MEFs。（B-C）RAD51平均数的量化（比较时60分钟和120分钟时p<0.05平方毫米1^−/−Sc siRNA与所有其他条件）（B）和TP53BP1（C）焦点在照射后的指定时间*平方毫米1*^−/−和*平方毫米1*^−/−+FLAG-SQSTM1用对照或弗纳小干扰RNA。（D） HR和NHEJ报告系统示意图。A类*GFP公司*含有杀手内含子和I-SceI识别位点的基因整合到正常人皮肤成纤维细胞中。I-SceI转染后，产生DSB，可以通过NHEJ或HR修复，从而产生活性GFP。（E）用I-SceI质粒和指示的siRNA转染具有完整HR报告子的人皮肤成纤维细胞，2天后用流式细胞术进行分析。显示了GFP与DsRed百分比的量化。（F）用I-SceI质粒和指示的siRNA转染带有完整NHEJ报告子的人皮肤成纤维细胞，2天后用流式细胞仪进行分析。显示了GFP与DsRed百分比的量化。n=3；误差条代表SEM；NS，不显著；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。

**图6。**
SQSTM1在DDR中的角色示意图。DNA损伤后，FLNA提供了一个支架来支持RAD51的招募并促进DNA修复。我们已经证明，SQSTM1可以与DNA损伤（此处由X射线照射诱导）后的FLNA蛋白酶体相互作用并促进其降解。高水平的核SQSTM1增加了FLNA的降解，这对RAD51募集到DNA损伤位点产生了负面影响，因此增加了DNA损伤完全修复所需的时间。这些结果对衰老具有重要意义，因为SQSTM1水平通过自噬和蛋白酶体降解由其自身的周转仔细调节；两者的扰动在老化模型中得到了证明。SQSTM1核水平的变化可能直接导致DDR缺陷，进一步加重衰老相关的病理。自噬与SQSTM1、FLNA和SQSTM的核水平以及RAD51和DNA损伤之间的反向相关性如图所示。

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