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.2016年8月26日；291(35):18283-98.
doi:10.1074/jbc。M115.703157。 Epub 2016年7月6日。

帕金森病相关Vps35 R524W突变破坏逆转录酶的内切酶关联并诱导α-突触核蛋白聚集

乔丹·福利特 1, 安德烈亚·布加西奇 1, 哲阳（Zhe Yang） 1, 尼古拉斯·阿里奥蒂 1, 苏珊·诺伍德 1, 布雷特·M·柯林斯 1, 罗伯特·G·帕顿 2, 罗汉·D·提斯代尔 3
附属公司

帕金森病相关Vps35 R524W突变破坏逆转录酶的内切酶关联并诱导α-突触核蛋白聚集

乔丹·福利特等。 生物化学杂志. .

摘要

内体分选是一个高度协调的细胞过程。逆转录酶是一种异源三聚体复合物，与内质体膜结合，促进多种受体的逆行分选，包括溶酶体酶的阳离子非依赖性甘露糖6-磷酸受体。逆转录酶在内胚体膜上和外的循环受逆转录酶相互作用蛋白网络的调节。在这里，我们发现帕金森病相关的Vps35变异体R524W，而非P316S，是一种功能丧失突变，其特征是与该调节网络的相关性降低，以及内体受体分类的失调。含有Vps35 R524W的逆转录体的表达导致细胞内α-同核蛋白阳性聚集物的积累，这是帕金森病的一个特征。总的来说，含有Vps35 R524W的逆转录酶具有减少的内胚体结合，R55可以部分地挽救这种结合，而R55是一种小分子，以前被证明可以稳定逆转录酶复合物，支持了逆转录酶复合体在帕金森病治疗中的未来靶向性。

关键词：帕金森病；内体；细胞内贩运；膜转运；蛋白质分选；逆转录酶。

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数字

图1。
图1。
帕金森病相关Vps35突变体P316S和R524W不会破坏三聚体的形成。 A类，Vps35点突变与逆转录酶亚基的等温滴定量热法，Vps29(左边)和Vps26A(正确的).B类和C类HeLa细胞全细胞裂解物中的GFP-NanoTrap免疫沉淀(B类)或胞质亚细胞组分(C类)瞬时表达GFP、Vps35 WT-GFP、Vps35P316S-GFP或Vps35R524W-GFP，然后对与抗GFP、抗Vps26A和抗Vps29抗体的沉淀复合物进行免疫印迹分析。D类从瞬时表达GFP、Vps35 WT-GFP、Vps35-P316S-GFP或Vps35-R524W-GFP的HeLa细胞中免疫沉淀内源性Vps26A，然后用免疫印迹分析沉淀的复合物与抗Vps35、抗Vps26A和抗Vps29抗体。在控制车道在没有主要抗Vps26A抗体的情况下，采用相同的实验程序。
图2。
图2。
Vps35 R524W阻断逆转录体向内胚层膜的募集。 A类用抗Vps26A免疫标记瞬时表达Vps35 WT-GFP、Vps35 P316S-GFP或Vps35 R524W-GFP的HeLa细胞共聚焦分析(n个=3，每组10张图像）。比例尺，5μm。B类，代表性免疫印迹(n个=4）瞬时表达Vps35 WT-GFP、Vps35 P316S-GFP或Vps35 R524W的HeLa细胞进行分馏、SDS-PAGE，并用针对所列蛋白的抗体进行免疫标记。C类用EEA1或LAMP1标记瞬时表达Vps35 WT-GFP、Vps35 P316S-GFP或Vps35 R524W-GFP的HeLa细胞的代表性免疫荧光图像，然后用DAPI进行复染。比例尺，5μm。D类，来自的联合本地化分析c（c）用皮尔逊相关系数表示。代表三个独立实验的图表，每组10张图像，5–7个转染细胞/视野(误差线，同上；*，第页< 0.05;纳秒，不显著；使用Tukey多重比较检验的方差分析）。WCL公司，全细胞裂解物。
图3。
图3。
Vps35-GFP的超微结构分辨率。 A类，单独转染APEX-GBP的HeLa细胞在细胞质中显示出强烈的电子致密反应产物。B类，EGFP与APEX-GBP共转染可产生唯一的细胞质电子密度。C类，Vps35 WT-GFP+APEX-GBP在转染细胞的内胚体处显示出显著的电子密度。箭头与细胞质相比，内胚体的电子密度增加。D类，Vps35 P316S-GFP与WT构造非常相似。箭头，与细胞质相比，内体具有增加的电子密度。E类Vps35 R524W-GFP表明，内体结合减少，可溶性反应产物增加。箭头，胞质上电子密度丰富的内体；箭头，内体无电子密度。F类，Vps35 D620N-GFP在转染细胞中用强烈的反应产物引起了内胚体的扩大。*，未转染的邻近细胞。比例尺，1微米。
图4。
图4。
Vps35 R524W减少了与逆转录酶调节器的联系。 A类对瞬时表达Vps35 WT-GFP、Vps35 P316S-GFP和Vps35 R524W-GFP的HeLa细胞进行FAM21免疫荧光染色，然后进行DAPI复染。比例尺，5μm。B类，来自的联合本地化分析A类用皮尔逊系数表示。代表三个独立实验的图表，每组10张图像，5–7个转染细胞/视野(误差线，S.E.；*，第页< 0.05;纳秒，不显著；方差分析与Tukey的多重比较测试）。C类，代表性免疫共沉淀(IP（IP）)GFP、Vps35 WT-GFP、Vps35P316S-GFP和Vps35R524W-GFP与来自HeLa细胞的内源性FAM21。D类，瞬时表达Vps35 WT-GFP、Vps35 P316S-GFP或Vps35 R524W-GFP的HeLa细胞的代表性免疫荧光图像，标记有晚期内体标记Rab7。比例尺，5μm。E类，来自的联合本地化分析D类用皮尔逊系数表示。图是三个独立实验的代表，每组10张图像，5–7个转染细胞/视野(误差线，S.E.；*，第页< 0.05;纳秒，不显著；使用Tukey多重比较检验的方差分析）。F类代表性的GFP、Vps35 WT-GFP、Vps35P316S-GFP和Vps35R524W-GFP与HeLa细胞内源性Rab7a的联合免疫沉淀。G公司，TBC1D5在表达用DAPI复染的Vps35 WT-GFP、Vps35 P316S-GFP或Vps35 R524W-GFP的HeLa细胞中的定位。比例尺，5μm。H（H），来自的联合本地化分析G公司用皮尔逊系数表示。代表三个独立实验的图表，每组10张图像，5–7个转染细胞/视野(误差线，S.E.；*，第页< 0.05;纳秒，不显著；方差分析与Tukey的多重比较测试）。我、TBC1D5与来自HeLa细胞的Vps35 WT-GFP-、Vps35 P316S-GFP-或Vps35 R524W-GFP-的逆转录物共同免疫沉淀的代表性Western blots。
图5。
图5。
逆转录酶的药理学稳定性增加其总水平和膜募集。 A类，用二甲基亚砜或5μ米R55用EEA1免疫标记并用DAPI复染。比例尺，5μm。B类，中观察到的共同定位的图形表示A类来自两个独立的实验，每个构造和时间点有10幅图像。误差线，S.E.；*，第页< 0.05;纳秒，不显著；方差分析，然后是Tukey的多重比较测试。C类瞬时表达GFP、Vps35 WT-GFP、Vps35P316S-GFP或Vps35R524W-GFP的HeLa细胞的代表性Western blot米R55或DMSO 48小时(n个= 3). 膜也使用抗LAMP1进行分析，以进行负载控制。
图6。
图6。
帕金森病相关Vps35点突变增加α-同核蛋白阳性聚集物的产生。 A类，SH-SY5Y细胞未经处理或经KCl处理诱导形成α-突触核蛋白聚集体(箭头)用抗α-突触核蛋白结合磷酸化α-突触核蛋白（phospho-Se-129）抗体、自噬标记物p62、溶酶体标记物LAMP1和蛋白聚集标记物硫黄素S进行免疫荧光检测。比例尺，2微米。B类稳定表达GFP或GFP-α-突触核蛋白的SH-SY5Y细胞在50 m米按照“实验程序”中的描述，用KCl浸泡60分钟或进行半处理，然后静置48小时恢复。产生可溶和不可溶部分，并通过Western blotting进行分析。每个通道中装载40μg蛋白质。较高的曝光率(高Ex显示GFP-α-突触核蛋白的(低Ex。)等于可溶部分。C类表达GFP融合构建物的SH-SY5Y细胞的共聚焦免疫荧光图像，用抗α-突触核蛋白进行免疫标记，并在KCl治疗后用DAPI进行复染。比例尺，5μm。D类，图中表示在用DMSO或5μ米R55持续48小时。该图表示具有α-突触核蛋白的细胞的比例，这些细胞聚集在三个独立实验的20–30个随机图像中。误差线，同上；*，第页< 0.05;纳秒，不显著；方差分析后进行Tukey多重比较检验。
图7。
图7。
Vps35 R524W的表达干扰了CI-M6PR的定位和排序。 A类，GFP融合构建物的代表性联合免疫沉淀，CD8-M6PR报告子通过SDS-PAGE解析。膜用抗CD8免疫标记。B类瞬时转染Vps35 WT-GFP、Vps35 P316S-GFP或Vps35 R524W-GFP并与100μg/ml环己酰胺孵育7小时的HeLa细胞培养基和细胞裂解物的代表性免疫印迹(n个= 3). 用抗β-微管蛋白和组织蛋白酶D的抗体探测膜。C类共聚焦分析瞬时表达Vps35 WT-GFP、Vps35 P316S-GFP或Vps35 R524W的HeLa细胞，用内源性CI-M6PR抗体进行免疫标记，并用DAPI进行复染。比例尺，5μm。D类，中观察到的共同定位的图形表示C类。该图表示三个独立实验，每组10张图像，每组5–7个转染细胞/视野(n个= 3;误差线，S.E.；*，第页< 0.05;纳秒，不显著；方差分析，然后是Tukey的多重比较测试）。E类，追踪30分钟后表达CD8-CIM6PR和GFP融合构建物的HeLa细胞的代表性图像，用抗CD8和抗p230免疫标记(红色)和抗CD8(绿色)抗体。比例尺，5μm。
图8。
图8。
Vps35 R524W不会中断依赖SNX27的货物回收。 A类用抗SNX27免疫标记瞬时表达Vps35 WT-GFP、Vps35 P316S-GFP或Vps35 R524W-GFP的HeLa细胞的免疫荧光。比例尺，5μm。B类，中观察到的共同定位的图形表示A类图是三个独立实验的代表，每组10张图像，5–7个转染细胞/视野(误差线，S.E.；*，第页< 0.05;纳秒，不显著；方差分析，然后是Tukey的多重比较测试）。C类表达Vps35 WT-GFP、Vps35 P316S或Vps35 R524W-GFP的HeLa细胞中SNX27与Vps26A的皮尔逊系数(误差线，S.E.；*，第页< 0.05;纳秒，不显著；方差分析，然后是Tukey的多重比较测试）。D类，免疫共沉淀(IP（IP）)使用GFP的GFP纳米陷阱，Vps35 WT-GFP、Vps35 P316S-GFP和Vps35 R524W-GFP以及内源性SNX27。E类，表达Vps35 WT-GFP、Vps35 P316S-GFP或Vps35 R524W-GFP的HeLa细胞的代表性免疫荧光图像，然后与抗GLUT1和抗LAMP1联合免疫标记。比例尺，5μm。F类，代表性蛋白质印迹(n个=3）表达GFP融合结构的HeLa细胞显示细胞表面生物素化和总GLUT1水平。G公司，用GFP融合构建体瞬时转染的HeLa细胞中葡萄糖摄取的图示。纳秒，不显著。数据代表了三个独立实验，一式三份。误差线、瑞典。
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