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.2016年7月1:5:e11853。
doi:10.7554/eLife.11853。

胎鼠肝脏糖皮质激素受体-PPARα轴为新生儿乳脂分解代谢做好准备

詹保罗·兰多 1, 赤坤滩 2, 努尔赫内·哈立德 1, 亚历山大·蒙塔格纳 三, 尼古拉斯·伦伯格 1, 贾斯汀·贝特朗·米切尔 4, 埃斯瓦里·帕拉马林加姆 2, 赫韦·吉卢 三, 沃尔特·瓦利 1 2 三
附属公司

胎鼠肝脏糖皮质激素受体-PPARα轴为新生儿乳脂分解代谢做好准备

詹保罗·兰多等。 埃利夫. .

摘要

在哺乳动物中，肝脏脂质分解代谢对于新生儿有效利用乳脂作为能量来源至关重要。然而，尚不清楚这一关键特性是如何获得和调控的。我们证明，在PPARα的控制下，脂肪分解代谢所需的基因在出生前转录，因此新生儿肝脏在哺乳时具有迅速从牛奶中提取能量的能力。其机制涉及胎儿糖皮质激素受体（GR）-PPARα轴，其中GR通过与其启动子结合直接调节PPARα的转录激活。某些PPARα靶基因（如Fgf21）在胎肝中仍然受到抑制，并在出生后在β-羟丁酸介导的HDAC3抑制所触发的表观遗传转换后成为PPARα反应性基因。本研究确定了一个内分泌发育轴，在该轴中，胎儿GR启动PPARα的活性，以预测出生后营养来源和代谢需求的突然变化。

关键词：FGF21；HDAC3；PPARα；发育生物学；糖皮质激素受体；肝脂肪变性；酮体；小鼠；干细胞。

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数字

图1。
图1.GR直接控制胎儿PPARα的表达。
(A类,B类)致体表达编号3c1(A类)和Ppara公司(B类)mRNA在发育中的小鼠肝脏中表达*与E13样品相比，p<0.05，**p<0.01；#p<0.05，##与WT同行相比，p<0.01。(C类)使用抗Pol2抗体或免疫前控制IgG（含或不含PPARα激动剂（WY-14643））在怀孕母鼠中富集含有PPARαTSS的DNA片段**p<0.01，***p<0.001，与未经WY-14643治疗的相应WT组相比。(D类)Ppara公司E15中的mRNA水平Ppara公司+/+用或不用地塞米松（Dex）处理24小时的肝外植体。使用0.1μM、1μM和10μM的Dex浓度。溶媒对照组用0.1%乙醇治疗*与车辆控制相比p<0.05。(E类,F类)E17 GR模型胎肝PPARα及其靶基因的mRNA表达。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001与。编号3c1+/+肝脏。(G公司)GRE一致序列与位于PPARα启动子上游的三个假定GRE序列对齐。(H（H）)使用抗GR抗体或免疫前控制IgG富集E17胎肝中−1007至−993、−2080至−2066和−2953至−2939区域的PPARα启动子内发现的含有三个假定GRE的DNA片段。富集水平表示为输入百分比。GR靶向siRNA被用于击倒编号3c1表达并确定GR与该假定GRE结合的特异性。*与非靶向siRNA治疗组相比，p<0.05。(我)PPARα启动子的GRE跨度-1007至−993的富集Ppara公司+/+发育过程中的肝脏*与E13样本相比，p<0.05、**p<0.01。数据表示为平均值±SEM；n=4-6。使用双尾Mann-Whitney检验进行统计分析。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.11853.003
图2。
图2 PPARα是足月胎儿的一种功能转录因子。
(A类)基因热图在E19.5（左面板）或P2（右面板）显著改变Ppara公司-/-肝脏（红色：上调；蓝色：下调）。基因按胎儿（E19.5）或出生后（P2）表达分组，并根据对数倍变化（log）的调节强度排序2FC）。(B类)基因本体论概述了产前和产后PPARα介导的代谢途径调控。(C类)具有不同胎儿（E19.5）和出生后（P2）调节的典型PPARα靶基因的mRNA水平Ppara公司-/-和Ppara公司+/+肝脏。Slc25a20系列：肉碱转移酶；Cpt2号机组：肉碱棕榈酰转移酶2；工厂1：脂肪酸结合蛋白1；19磅：过氧化物酶体生物生成因子19；Acox1型：过氧化物酶体酰基辅酶A氧化酶1；Cyp4a14细胞：细胞色素P450 4A14；第21层：成纤维细胞生长因子21；Angptl4号机组：血管生成素样蛋白4；Acaa2公司：乙酰-CoA酰基转移酶2；阿卡德尔：酰基辅酶A脱氢酶，长链；阿卡德夫：酰基辅酶A脱氢酶，超长链；Acsl1公司：酰基辅酶A合成酶，长链家族成员1。数据表示为平均值±SEM；与野生型对照组相比，n=6，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；#p<0.05，##p<0.01，###与相应的E19.5样本相比，p＜0.001。(D类)肝母细胞（DLK）的流式细胞术分析+)和肝细胞（CK18+)E19.5胎肝。(E类)mRNA表达水平Nr3c1、Ppara和参与过氧化物酶体生物发生的PPARα靶基因(19磅)、过氧化物酶体和线粒体FAO(Acox1、Acaa2、Acadl、Acadvl、和Acsl1公司)在分类的胎儿成肝细胞和肝细胞部分。糖酵解基因（例如。，Gc公司k和香港1号)也与氧化基因平行进行了研究。编号3c1：糖皮质激素受体；Ppara公司：过氧化物酶体增殖物激活受体α；ud：待定；格克：葡萄糖激酶；香港1号：己糖激酶1。数据表示为平均值±SEM；与野生型对照组相比，n=4，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.11853.004
图2——图补充1。
图2-图补充1。PPARα缺乏导致基因补偿性上调。
(A类)维恩图描述了细胞中上调基因的数量Ppara公司-/-出生前（E19.5）和出生后（P2）肝脏PPARα调节重叠（假发现率<0.05）。绝对折叠变化截止值设置为1.3。(B类)基因热图在E19.5（左面板）或P2（右面板）显著改变Ppara公司-/-肝脏（红色：上调；蓝色：下调）。基因根据胎儿或出生后的表达进行分组，并根据基于对数倍变化（logFC）的PPARα调节强度进行排序。(C类,D类)上调和下调核受体和共同调节器(C类)和核受体靶基因(D类)英寸Ppara公司-/-肝脏。内政部： 网址：http://dx.doi.org/10.7554/eLife.11853.006
图3。
图3线粒体功能缺陷、脂肪酸氧化和能量生成Ppara公司-/-肝细胞。
(A类,B类)原代肝细胞内过氧化物酶体和线粒体的流式细胞术分析Ppara公司-/-和Ppara公司+/+E19.5处的肝脏(A类)和P2(B类)分别使用Alexa Fluor 488标记的过氧化物酶体膜蛋白70和Mitotracker Red抗体。(C类,D类)线粒体膜电位的流式细胞术分析（∆Ψ米) (C类)和细胞内活性氧(D类)在分离自Ppara公司-/-和Ppara公司+/+分别使用四甲基罗丹明乙酯（TMRE）和2’，7’-二氯荧光素二醋酸盐（DCFDA）在E19.5和P2的肝脏。(E类)原代肝细胞中ATP的产生Ppara公司-/-和Ppara公司+/+在葡萄糖（+Glu）、半乳糖（+Gal）或鱼藤酮（+Rot，一种线粒体电子运输链复合物I抑制剂）作为阴性对照的存在下，肝脏（每组n=4）。数值表示归一化为活细胞数量的任意生物发光单位。(F类,G公司)原代肝细胞的耗氧率（OCR）Ppara公司-/-和Ppara公司+/+肝脏中是否存在棕榈酸酯和线粒体β-氧化抑制剂依托莫西。数据以延时形式显示(F类)和治疗终点(G公司)基础呼吸15min，棕榈酸盐治疗50min，棕榈酸酯加依托莫西治疗80min。数据表示平均值±SEM；n=3–9，除非另有说明，否则与野生型对照相比，**p<0.01，***p<0.001；###p<0.001与无治疗组比较；§§§与棕榈酸酯治疗组相比，p<0.001（双尾Mann-Whitney检验）。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.11853.007
图4。
图4 PPARα缺乏导致出生后先天性肝脂肪变性。
(A类)解剖后的照片Ppara公司-/-和Ppara公司+/+幼崽(左边)和肝脏(正确的). 苍白的肝脏Ppara公司-/-小狗用箭头表示。胃中的白色成分表明摄入了牛奶。(B类)代表性油红O染色肝切片用亚甲基蓝复染。比例尺=100μm。(C类——G公司)平均体重(C类)、甘油三酯(D类)和胆固醇酯(E类)肝脏内容物和血清甘油三酯水平(F类)和β-羟基丁酸（β-OHB）(G公司). 数据表示为平均值±SEM；与野生型对照组相比，n=6，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；#与各自的E19.5相比p<0.05；ns，不显著（Bonferroni事后分析的双向方差分析）。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.11853.008
图4——图补充1。
图4补充图1.出生后的脂肪分解代谢紊乱Ppara公司-/-幼崽。
(A类,B类)显示ω-3的方框图(A类)和ω-6(B类)分别根据二十二碳六烯酸与α-亚麻酸和花生四烯酸与亚油酸的比值计算P2肝脏的指数。方框表示第25至75百分位，胡须代表整个范围；n=16，***p<0.001（双尾Mann-Whitney检验）。(C类)冷冻切片的油红O染色PPARα-/- 出生后第几天的肝脏。注意肝脂肪变性的发病和逐渐恢复Ppara公司-/- 从P2到P15的小鼠。(D类)气相色谱-高效液相色谱法测定肝甘油三酯含量；与野生型对照组相比，n=4-6，**p<0.01，***p<0.001；ns，不显著（双尾Mann-Whitney检验）。(E类——H（H）)5日龄婴儿10天高脂肪断奶挑战Ppara公司+/+和Ppara公司-/-幼崽。显示了亚甲蓝复染后油红O染色肝脏切片的代表性图像(E类). 最右侧的面板显示了挑战后第15页的解剖肝脏。注意苍白的颜色Ppara公司-/-肝脏。比例尺=100μm。湿肝重量(F类)、肝甘油三酯水平(G公司)和血清甘油三酯水平(H（H）)在喂食对照组（Ctrl）或高脂肪饮食（HFD）的P15幼崽中测量。(我)肝细胞特异性敲除PPARα的肝脏冷冻切片的油红O染色(Ppara公司飞行/飞行阿尔布Cre公司/+)和控制(Ppara公司飞行/飞行)出生后第三天的幼崽（P3）。比例尺=100μm。条形代表平均值±SEM；n=4-6，**p<0.01，与相同饮食治疗下的野生型对照组相比（双向方差分析与Bonferroni事后分析）。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.11853.009
图4——图补充2。
图4补充图2.哺乳期缺陷氧化代谢和酮生成的无补体补偿Ppara公司-/-幼崽。
(A类,B类)体重(A类)和血糖水平(B类)第页，共页Ppara公司+/+和Ppara公司-/-出生后指定天数的幼崽。(C类)P2时肝裂解物中丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性的测定。(D类)糖异生途径Ppara公司-/-肝脏在P2时通过丙氨酸的回复代谢供应丙酮酸。(E类)受影响的氨基酸氧化途径Ppara公司-/-肝脏位于P2。颜色表示微阵列分析确定的基因上调（红色）或下调（蓝色）。上调基因是哈尔(1),尿路1号(2),修正案1(3),Ftcd公司(4),胶水(5),派克(6),燕麦(7),传真（8） ，Asl公司(9),资产1(10),得到2(11),得到1(12),Sds公司(13),联邦直辖市(14),抄送(15),Cdo1公司(16),得到1(17),Sds公司(18),Gpt公司（19） ，个人电脑(20). 下调的基因是埃哈德(21,22,24),Hibch公司(23),嗯2(25),哼哼(26). (F类,G公司)体重(F类)和血糖(G公司)每天腹腔注射30 mg/kg L-环丝氨酸两天（P4）、三天（P5）和四天（P6）之前和之后的P2幼鼠。条形代表平均值±SEM；与野生型对照组相比，n=4-6，*p<0.05，**p<0.01（双向Mann-Whitney试验）。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.11853.010
图5。
图5.出生前后PPARα靶基因调控的时间二分法。
(A类)免疫印迹显示细胞质和细胞核GR、HDAC3、PPARα及其靶基因，包括ACOX1、Cyp4A14、FGF21和全长（FL）-ANGPTL4的个体发生表达Ppara公司-/-和Ppara公司+/+肝脏。U2AF65和β-微管蛋白分别用作核蛋白和细胞质蛋白的负荷控制。(B类——D类)在ACOX1上富集含有PPAR反应元件（PPRE）的DNA片段（左面板）(B类)，Cyp4A14(C类)和FGF21(D类)启动子或其各自的TSS（右面板）使用抗PPARα和抗Pol2抗体或前免疫IgG。数据表示为平均值±SEM；与未经治疗的野生型对照组相比，n=4-6，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001（双尾Mann-Whitney检验）。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.11853.011
图6。
图6 PPARα介导的第21层表达由HDAC3在其启动子上的占有率决定。
(A类——C类)含有ACOX1的DNA片段的富集(A类)，Cyp4A14(B类)或FGF21(C类)原代肝细胞中TSS的分离Ppara公司+/+使用针对乙酰-睾酮四型（AcH4）、赖氨酸四型（H3K4me3）三甲基组蛋白三型、赖氨酸九型（H3C9me3）、赖胺酸27型（H3G27me3）或免疫前IgG（Ctrl-IgG）的抗体的幼崽，并通过实时qPCR进行评估。(D类——F类)含有FGF21的DNA片段的富集(D类)，角度4(E类)，或Cyp4A14(F类)原代肝细胞中TSS的分离Ppara公司-/-和Ppara公司+/+使用抗HDAC3抗体或对照IgG对怀孕母鼠进行WY-14643治疗或不进行WY-4643治疗的幼崽。数据表示为平均值±SEM；与未经处理的野生型对照组相比，n=4-6，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，除非另有说明（双尾Mann-Whitney检验）。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.11853.012
图7。
图7.β-羟基丁酸作为HDAC3的内源性抑制剂激活第21层哺乳时的表情。
(A类——C类)离体肝移植体分离自Ppara公司+/+使用E19.5的胎儿研究丁酸盐、β-羟基丁酸盐和曲古抑菌素在WY-14643（WY）存在或不存在的情况下对PPARα靶基因的影响。左侧：mRNA表达第21层(A类),Cyp4a14细胞(B类)、和Acox1型(C类).赖特：富集含有FGF21的DNA片段(A类)，Cyp4A14(B类)，或ACOX1(C类)TSS在染色质免疫沉淀（ChIP）后使用抗乙酰基-睾酮4（AcH4）抗体。数据表示为平均值±SEM；n=6，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，与未经WY-14643处理的E19.5样本相比（双尾Mann-Whitney检验）。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.11853.013
图8。
图8.GR介导的PPARα表达调节、出生前后PPARα靶基因的HDAC3依赖性和非依赖性调节，以及有或没有PPARα时受影响的肝脏代谢过程的示意图。
(A类)在胎肝中，激素激活的GR与PPARα启动子区内跨越-1007到-993的GR反应元件（GRE）结合，直接激活PPARα的转录Ppara公司。NTD：N末端结构域，LBD：配体结合结构域，DBD：DNA结合结构域。(B类)在E19.5处，HDAC3在TSS附近直接结合第21层导致镇压第21层转录活性。哺乳后，新生儿肝脏中PPARα依赖性β-羟基丁酸的产生减轻了HDAC3介导的第21层通过直接抑制HDAC3的活性，允许PPARα依赖第21层表达式。激活的GR可刺激胎肝中的PPARα及其靶基因，如线粒体和过氧化物酶体脂肪酸氧化（FAO）相关基因。出生后，线粒体FAO中PPARα靶基因的表达主导过氧化物酶体FAO中相关基因的表达，可能是因为牛奶中的长链脂肪酸（LCFA）含量高于超长链脂肪酸量（VLCFA）。(C类)图示了PPARα存在和不存在时肝脏代谢受影响的过程。绿色方框/箭头表示增量；红色表示减量。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.11853.014
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