Initial characterization of a Syap1 knock-out mouse and distribution of Syap1 in mouse brain and cultured motoneurons

doi:10.1007/s00418-016-1457-0

.2016年10月；146(4):489-512.

doi:10.1007/s00418-016-1457-0。 Epub 2016年6月25日。

Syap1基因敲除小鼠的初步特征及其在小鼠脑和培养运动神经元中的分布

多米尼克·施密特¹, 娜塔莉亚·芬克¹, 罗伯特·布仑姆¹, 埃丝特·阿桑², 里尔·安徒生^三, 托马斯·吕利克^三, 迈克尔·森特纳¹, 埃里希·布奇纳⁴

附属公司

¹德国瓦茨堡Versbacher街5号瓦茨堡大学临床神经生物学研究所，邮编97078。
²德国维尔茨堡大学解剖与细胞生物学研究所，邮编97070。
^三奥地利维也纳兽医大学实验动物科学研究所，维也纳，1210。
⁴德国瓦茨堡Versbacher街5号瓦茨堡大学临床神经生物学研究所，邮编97078。Buchner_E@ukw.de。

PMID： 27344443
预防性维修识别码：项目编号：5037158
内政部： 2007年10月10日/00418-016-1457-0

Syap1基因敲除小鼠的初步特征及其在小鼠脑和培养运动神经元中的分布

多米尼克·施密特等。组织化学细胞生物学. 2016年10月.

.2016年10月；146(4):489-512.

doi:10.1007/s00418-016-1457-0。 Epub 2016年6月25日。

作者

多米尼克·施密特¹, 娜塔莉亚·芬克¹, 罗伯特·布仑姆¹, 埃丝特·阿桑², 里尔·安徒生^三, 托马斯·吕利克^三, 迈克尔·森特纳¹, 埃里希·布奇纳⁴

附属公司

¹德国瓦茨堡Versbacher街5号瓦茨堡大学临床神经生物学研究所，邮编97078。
²德国维尔茨堡大学解剖与细胞生物学研究所，邮编97070。
^三奥地利维也纳兽医大学实验动物科学研究所，维也纳，1210。
⁴德国瓦茨堡Versbacher街5号瓦茨堡大学临床神经生物学研究所，邮编97078。Buchner_E@ukw.de。

PMID： 27344443
预防性维修识别码：项目编号：5037158
内政部： 2007年10月10日/00418-016-1457-0

摘要

突触相关蛋白1（Syap1/BSTA）是果蝇Sap47（突触相关蛋白质47kDa）的哺乳动物同源物。Sap47缺失突变幼虫表现出短期突触可塑性降低和关联行为可塑性缺陷。在培养的脂肪细胞中，Syap1作为复合物的一部分发挥作用，该复合物在Ser（473）磷酸化蛋白激酶Bα/Akt1（Akt1）并促进分化。Syap1在脊椎动物神经系统中的作用尚不清楚。在这里，我们生成了一只Syap1基因敲除小鼠，并表明缺乏Syap1与生存能力和生育能力兼容。成年敲除小鼠的大脑形态没有明显缺陷。在野生型大脑中，Syap1广泛分布于突触神经膜中，尤其是富含谷氨酸能突触的区域，但也存在于与特定神经元胞体高尔基体相关的核周结构中。在培养的运动神经元中，Syap1位于轴突和生长锥内，富集于与高尔基体标记物部分重叠的核周区域。我们详细研究了Syap1敲除和敲除对这些细胞结构和发育的影响。重要的是，Syap1基因敲除并不影响运动神经元存活或轴突生长。出乎意料的是，在培养的运动神经元中，Syap1的敲除和敲除均与Akt的Ser（473）或Thr（308）磷酸化降低无关。我们的研究结果表明Syap1在小鼠中枢神经系统中广泛表达，具有区域特异性分布模式，特别是在嗅球、海马和小脑中。

关键词：BSTA；大脑；谷氨酸能突触；PKB/Akt磷酸化；Syap1本地化；可行性。

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利益冲突声明

作者没有利益冲突需要声明。

数字

图1
靶向突变1a等位基因示意图(*Syap1公司* ^{tm1a（EUCOMM）Hmgu})鼠标的*Syap1公司*基因(一,*文本中的详细信息*)小鼠Syap1蛋白的氨基酸序列(b条)和融合蛋白(*红色氨基酸*)在敲除小鼠中表达(b条,**c（c）**). Syap1外显子1-3编码红色中的序列b条拼接到编码小鼠雕刻-2蛋白片段的序列上，如**c（c）**.BSD结构域的保守氨基酸(*下划线的*在里面b条)标记为蓝色

图2
验证*Syap1公司*敲除和演示Syap1蛋白在不同组织中的表达。一用来自小鼠皮层的信使核糖核酸和连接的引物进行qRT-PCRSyap1公司外显子3和外显子4表明完整的转录水平在*Syap1公司* ^tm1a型突变体(曲线三,4)与野生型相比增加了约30倍(曲线 1,2).曲线 5表示背景（无逆转录酶）。b条通过Western blots分析的指示组织的裂解物显示，在野生动物的所有测试大脑区域中Syap1蛋白表达水平相当-型小鼠。然而，该蛋白也在非神经组织中检测到，如肝脏(*印迹的左半部分*). 没有从以下位置获得组织的Syap1信号*Syap公司* ^tm1a型突变小鼠(*污点的右半部分*).c（c）在来自*Syap公司* ^tm1a型突变体(*车道2*)即使在增加的蛋白质负荷和延长的暴露之后。两个弱者*上部频带*是不具体的，弱者*下部频带*可能代表Syap1降解产物。*污点顶部*在里面b条和**c（c）**：Calnexin信号作为加载控制

图3
野生型截面(一,b条,电子,**（f）**)和*Syap1公司*淘汰赛(**c（c）**,d日,克,小时)Syap1抗血清染色的大脑(左边)和DAPI(*正确的*). 在冠状切片中(一,**c（c）**)弥漫性Syap1特异性免疫标记遍布大脑所有部位，优先定位于灰质神经膜。*箭头点*与Syap1抗血清发生非特异性交叉反应的下丘脑细胞，因为它们在野生型和敲除型切片中都检测到，但在没有初级抗体的对照组中没有检测到（见图S3）。这个星号表示丘脑区域包含大量细胞，具有较强的核周Syap1特异性免疫荧光标记（图5中放大）。矢状位切片显示小脑皮质分子层中Syap1的免疫荧光特别强(电子,克).比例尺1毫米(*上面的*)，200微米(降低)面板

图4
在主嗅球中，嗅神经层观察到强烈的Syap1特异性免疫反应(星号)和肾小球(x个)野生型截面(一,**c（c）**). 二尖瓣层发现较低强度的Syap1信号(箭头在里面一). Syap1抗血清与敲除片段中的未知抗原弱交叉反应(b条,d日). 抗Syap1抗血清的双重免疫标记(左边)和抗TH(*中间的*)显示Syap1在肾小球神经膜中积聚。细胞核用DAPI染色[*覆盖层中为蓝色*(*正确的*)].比例尺200微米(*上半部分*)，50微米(*下半部分*)

图5
Syap1在丘脑的分布。一抗Syap1增强染色(左边)野生型丘脑的特定区域（图3a中由星号)用高尔基体标记物GM130双重染色(*中间的*)确定为Syap1特异性免疫荧光在高尔基体附近的核周堆积。黄色在扩大中a′表示Syap1和GM130的重叠，以及箭头指向缺乏Syap1免疫标记的推测为非神经元细胞中的GM130免疫活性高尔基体（如密集的DAPI染色细胞核所示）。**c（c）**Syap1特异性免疫荧光的核周积聚局限于神经元的一个亚群，如放大图所示(c′)用DAPI标记的核(蓝色)缺乏Syap1特异性免疫荧光(红色). 与中的淘汰部分进行比较b条和d日(*左侧和中间面板*)显示了由于抗Syap1抗血清的非特异性交叉反应而标记的精细荧光纤维状结构。*比例尺*25微米(一,**c（c）**); 5微米(a′,c′)

图6
Syap1在海马体中的分布。一在野生型切片中，Syap1特异性免疫荧光出现在一般神经膜中，在CA2胞体中观察到高水平的Syap1标记(*大箭头*)Syap1免疫反应在CA1或CA3胞体周围也可检测到较弱的程度(*小箭头*)与淘汰赛相比(b条,d日). 来自齿状回颗粒细胞的锥体下和锥体上苔藓纤维通路显示出强烈的Syap1特异性免疫反应(箭头). Syap1也存在于灵芝地层中。(**c（c）**,d日)抗Syap1和GM130双重染色CA2区的扩大表明核周Syap1与这些细胞的高尔基体有关。嗨，希卢斯；SG，颗粒层；SL，透明层；SLM，地层腔隙分子；SM，分子层；SO，地层方向；SP，金字塔状地层；SR，辐射层。*比例尺*200微米(一,b条)，50微米(**c（c）**,d日)，10微米(插入在里面**c（c）**)

图7
Syap1在小脑的分布。Syap1特异性免疫荧光积累与谷氨酸能突触神经膜重叠，后者通过抗vGlut1染色标记谷氨酸能神经元突触的囊泡谷氨酸转运体[与野生型相比(一,**c（c）**,电子)带敲除部分(b条,d日,**（f）**)]. 在放大图中(电子,**（f）**)中白色方块表示的区域**c（c）**和**日期：，**钙结合蛋白双标记鉴定Purkinje细胞中Syap1特异性免疫荧光的核周堆积(*中间立柱*在里面一–**c（c）**)是显而易见的(星号在里面电子)，但在延伸到分子层的这些细胞的大树突中也检测到Syap1(箭头在里面电子). 同样，Syap1免疫荧光与高尔基体标记物GM130的信号部分重叠(*黄色的*在里面c′,*最右边的图像*). 在颗粒层中(*灰色正方形*在里面**c（c）**)Syap1特异性免疫荧光与谷氨酸能突触重叠，但也存在于颗粒神经元的核周区和局部神经膜中（图S5c中放大）。蓝色核DAPI。*比例尺*100微米(一,b条)，25微米(**c（c）**,d日)，10微米(c′,电子,**（f）**)

图8
Syap1公司(一,**c（c）**,d日,左列)抗ChAT抗血清标记的脊髓神经膜和胆碱能细胞（运动神经元）(一–**c（c）**,*中间立柱*). 比较野生型截面(一)带敲除部分(b条).白盒中的单元格在里面一图中放大了**c（c）**和d日.胆碱能突触发作(箭头在里面**c（c）**)显示很少或没有Syap1特异性免疫荧光。同样，Syap1信号和GM130染色有相当大的重叠(箭头在里面d日).蓝色核DAPI。*比例尺*100微米(一,b条); 50微米(**c（c）**,d日)

图9
神经肌肉接头处的Syap1。通过比较突触素（SYP）和α-银环蛇毒素(α-BTX），在神经肌肉接头处鉴定出低水平的Syap1特异性免疫荧光，但在肌肉中也观察到突触外的Syap1信号。比较野生类型(一)带击倒准备(b条).比例尺10微米

**图10**
Syap1蛋白在原代培养运动神经元中的定位。一如图所示，培养5天的初级运动神经元的代表性图像，被Syap1和乙酰化微管蛋白染色，或与阴茎倍体蛋白共同染色。*Syap1公司*敲除细胞(b条,d日,**（f）**)和shRNA–*Syap1公司*-处理过的细胞(小时,j个,我)与野生型相比，Syap1免疫反应性显著降低(一,**c（c）**,电子)或未感染(克,我,k个)和sh-mismatch RNA（“模拟”）感染（未显示）对照。Syap1信号见于树突、胞体、轴突和轴突远端。放大的图像躯体的(**c（c）**,我)细胞质和树突中可见点状Syap1染色，核周堆积明显。Syap1信号也存在于生长锥中(电子,k个).蓝色核DAPI染色。*比例尺* 一,b条,克,小时：25微米；**c（c）**–**（f）**,我–我：10微米

**图11**
Syap1在高尔基体细胞器附近聚集。(一–d日)核周Syap1免疫反应部分与*顺式/内侧*-高尔基标记GM130(一,**c（c）**)和γ-adaptin，适配器蛋白复合物1的一种成分(b条,d日)（最大强度投影）。蓝色细胞核DAPI染色。(电子–小时)Syap1和GM130的SIM超分辨率成像或γ-自适应。图中显示了典型的单个光学截面。(电子,克)Syap1和GM130分配(**（f）**,小时)Syap1和γ-自适应分布。*橙色箭头*指向两个标签的同时出现，以及*白色箭头*表示Syap1-阳性，GM130-或γ-自适应-负信号。*比例尺* 一,b条,电子,**（f）**10微米；**c（c）**,d日5微米；克,小时2.5微米

**图12**
淘汰*Syap1公司*不会改变初级运动神经元的存活或轴突生长。一在不存在或存在BDNF的情况下培养7DIV的原代运动神经元的存活率的量化。在第1天和第7天分别对细胞进行计数。运动神经元的存活率与*Syap1公司*基因敲除（ko）与野生型（WT）胚胎的比较[n个=17（WT）和7（ko）独立文化]。未经BDNF培养的野生型细胞显示细胞存活率显著降低。b条培养7 DIV的初级运动神经元轴突长度不受*Syap1公司*淘汰赛(n个=288（WT）和237（ko）

**图13**
*Syap1公司*敲除或敲除不会显著影响Thr的Akt总磷酸化³⁰⁸和Ser⁴⁷³初级运动神经元。一BDNF（20 ng/ml）刺激的血清饥饿细胞的Western blot，时间序列为2 s至30 min。最大Akt-Thr³⁰⁸(*左侧污点*)和Ser⁴⁷³(*右侧螺栓*)神经营养素刺激2-5分钟后可实现磷酸化。b条野生型和野生型运动神经元的蛋白质印迹*Syap1公司*用BDNF刺激敲除胚胎5分钟后，Thr处Akt磷酸化水平没有降低³⁰⁸(*左侧污点*)或Ser⁴⁷³(*右侧螺栓*)由于*Syap1公司*淘汰赛。Calnexin和pan-Akt作为负荷控制，而GFP水平表明细胞感染呈阳性。**c（c）**,d日斑点属于*Syap1公司*shRNA感染的运动神经元和未感染和模拟感染的对照刺激2个(**c（c）**)或五个(d日)分钟。Thr的Akt磷酸化无差异³⁰⁸(*左侧斑点*)和Ser⁴⁷³(*右斑点*)之后观察到*Syap1公司*与控制相比，击倒。Syap1的检测(*右斑点*)表明敲除后Syap1蛋白水平显著降低。这些和类似信号的量化斑点如图S8所示

**图14**
pAkt公司^Ser473系列/受刺激运动神经元的不同隔室中的Akt比率没有改变。在CNTF（5 ng/ml）存在的情况下进行5次DIV后，细胞被血清和神经营养因子剥夺6-7小时，用BDNF（20 ng/ml^Ser473系列、Akt和GFP。pAkt的分区特定量化^Ser473系列/Akt比值如图S9所示。pAkt公司^Ser473系列/经BDNF刺激后，Akt比率显著增加，但pAkt具有可比性^Ser473系列/Akt值是在*Syap1公司*在所有测试的运动神经元隔室中进行击倒或模拟治疗。*比例尺*体细胞和轴突：10µm；生长锥：5µm

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