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.2016年8月2日；12(8):1272-91.
doi:10.1080/15548627.2016.1183081。 Epub 2016年6月23日。

SESN2/倍半萜烯2通过诱导巨噬细胞有丝分裂和抑制NLRP3活化抑制脓毒症

金敏姬 1 2, Soo Han Bae先生 三, Jae-Chan Ryu先生 1 2, Younghee Kwon先生 1 2, Ji-Hwan噢 1 2, Jeongho Kwon先生 4, Jong-Seok Moon先生 5 6, 金京波（Kyubo Kim） 7, 宫崎Atsushi Miyawaki 8, 李敏古 2 三 9, Jaekyoon Shin先生 4, 年轻的Sam Kim 10, Chang-Hoon Kim先生 11 12, 斯特凡·赖特 5 6, 奥古斯丁·M·K·崔 5 6, 苏·古·李 三, Ji-Hwan Ryu先生 2 三, Joo-Heon Yoon先生 1 2 11 12
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SESN2/倍半萜烯2通过诱导巨噬细胞有丝分裂和抑制NLRP3活化抑制脓毒症

金敏姬等。 自噬. .

摘要

在各种炎症性疾病中，适当调节线粒体的吞噬功能以实现线粒体内环境的稳定非常重要。然而，激活有丝分裂来调节炎症反应的确切机制尚不清楚。NLRP3（NLR家族，含吡啶结构域3）炎性体是触发CASP1（caspase 1）激活和促炎细胞因子分泌的平台。在这里，我们证明SESN2（倍体蛋白2），也称为应激诱导蛋白，通过在巨噬细胞中诱导有丝分裂来清除受损线粒体，从而抑制NLRP3炎症小体的长期激活。SESN2在炎症小体激活反应中诱导有丝分裂中发挥双重作用。首先，SESN2通过标记线粒体以供自噬机制识别来诱导“线粒体启动”。对于线粒体的制备，SESN2通过介导SQSTM1（隔离体1）的聚集及其与线粒体表面赖氨酸63（Lys63）连接的泛素的结合，促进线粒体的核周聚集。其次，SESN2通过增加ULK1（unc-51样激酶1）蛋白水平，激活特定的自噬机制，降解启动的线粒体。此外，延长LPS（脂多糖）刺激引起的SESN2表达增加是由巨噬细胞中NOS2（一氧化氮合酶2，诱导型）介导的NO（一氧化氮）介导的。因此，Sesn2缺陷小鼠表现出有缺陷的有丝分裂，这导致炎症小体过度激活，并增加了2种不同脓毒症模型的死亡率。我们的研究结果定义了一种独特的调节机制，即有丝分裂激活以实现免疫稳态，从而保护宿主免受脓毒症的侵袭。

关键词：NLRP3炎症小体；SESN2；自噬；线粒体启动；有丝分裂；败血症。

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数字

图1。
图1。
SESN2抑制NLRP3依赖性CASP1激活，以响应长时间（12小时）LPS启动和ATP治疗。（A和B）赛斯2−/−小鼠和相应的野生型同窝小鼠(Sesn2号机组+/+)用LPS（0、6和12小时）刺激骨髓源性巨噬细胞，然后进行30分钟的ATP治疗。（A） 免疫印迹分析显示的蛋白质和（B）通过ELISA测定的IL1B、IL18和TNF的产生。（C和D）Sesn2号机组+/+和赛斯2−/−BMDM接受LPS和/或ATP治疗。（C） 通过ELISA测定的指示蛋白质的免疫印迹分析和（D）IL1B、IL18和TNF的产生。（E和F）Sesn2号机组+/+和赛斯2−/−BMDM先用脂多糖（LPS）预处理，然后用尼葛霉素（nigericin）处理。（E） 通过ELISA测定的指示蛋白质的免疫印迹分析和IL1B、IL18和TNF的（F）生成。（G和H）Nlrp3号机组+/+和nlrp3型−/−用LPS引发BMDM，然后进行ATP处理。（G） 通过ELISA测定的指示蛋白质和IL1B、IL18和TNF（H）生成的免疫印迹分析。所示数据是3个独立实验的代表性数据，是平均值±s.e.m.***，第页<0.005来自方差分析，随后是Tukey的事后检验。
图2。
图2。
抑制NOS2介导的NO生成会降低SESN2的表达，并增加CASP1的激活。（A-C）BMDM在有或无L-NAME的情况下用LPS（0、6、12小时）预处理，然后有或无ATP处理。（A） NO生成，（B）指示蛋白质的免疫印迹分析，以及（C）ELISA测定的IL1B、IL18和TNF的生成。（D-F）2个+/+和一氧化氮合酶2−/−BMDM先用脂多糖（LPS）预处理（12 h），然后再进行ATP处理。（D） NO生成，（E）指示蛋白质的免疫印迹分析，以及（F）通过ELISA测定的IL1B和IL18的生成。所示数据是3个独立实验的代表性数据，是平均值±s.e.m.***，第页<0.005来自ANOVA和Tukey的事后检验。
图3。
图3。
SESN2是维持线粒体对LPS和ATP刺激的稳态所必需的。（A-C）Sesn2号机组+/+或赛斯2−/−BMDM先用脂多糖（LPS）预处理（12 h），然后再进行ATP处理。流式细胞术检测BMDM，（A）MitoSOX染色15分钟，（B）MitoTracker深红色和MitoTracher绿色染色15分钟和（C）ANXA5-FITC染色5分钟。（D和E）Sesn2号机组+/+或赛斯2−/−BMDM与Mito-TEMPO（500µM）孵育1小时，然后进行LPS和ATP处理。（D） 通过ELISA测定的指示蛋白质和（E）IL1B和TNF的产生的免疫印迹分析。所示数据代表3个或更多独立实验，为平均值±s.e.m.***，第页<0.005来自方差分析，随后是Tukey的事后检验。
图4。
图4。
SESN2通过促进受损线粒体的核周聚集来诱导线粒体制备。（A-C）BMDM用LPS（12 h）启动，然后进行ATP处理。（A） 细胞溶质（C）、线粒体（M）蛋白组分和全细胞裂解物中指示蛋白质的免疫印迹分析（输入）（B）细胞溶质和线粒体蛋白组分及输入中SESN2免疫沉淀物（IP）中SQSTM1的免疫印记分析，以及（C）PLA的代表性共焦图像（邻近连接分析）使用SESN2和SQSTM1及其与MitoTracker Deep Red的共定位。比例尺：25μm。（D-J）Sesn2号机组+/+或赛斯2−/−BMDM先用脂多糖（LPS）预处理（12 h），然后再进行ATP处理。（D） SQSTM1与TOMM20（线粒体表面膜蛋白）共定位的代表性共焦免疫荧光图像，比例尺：25μm，（E）总细胞中具有SQSTM1的细胞的定量，（F）对总细胞中SQSTM1与核周簇状线粒体共定位的细胞进行量化（在2个独立实验中，每组>150个细胞），以及（G）在含有巴非霉素A1和（H）的情况下，对细胞溶质和线粒体蛋白质组分中的指示蛋白质进行免疫印迹分析SQSTM1和Lys63-ubiquitin（UB）的PLA及其与MitoTracker Deep Red的共定位。比例尺：25μm，（I）总细胞中含有SQSTM1和Lys63-ubiquetin的细胞的定量，（J）对总细胞中SQSTM1和Lys63-泛素与核周簇状线粒体共定位的细胞进行量化（在2个独立实验中，每组>150个细胞）。通过免疫印迹VDAC1（电压依赖性阴离子通道1）和CASP3（细胞溶质蛋白）评估组分的纯度。所示数据代表3个独立实验。*，p<0.05; ***,第页<0.005来自方差分析，随后是Tukey的事后检验。NS，不显著。
图5。
图5。
Sesn2诱导自噬体形成并增加有丝分裂活性。（A-C）Sesn2号机组+/+GFP-MAP1LC3和赛斯2−/−用LPS（0、6、12小时）引发GFP-MAP1LC3 BMDM，然后进行ATP处理。（A） GFP-MAP1LC3和TOMM20的典型共焦免疫荧光图像。比例尺：25μm。（B） 对总细胞中具有3个以上强GFP-MAP1LC3点的细胞和（C）具有GFP-MAP1点的细胞进行量化，并对具有GFP-MAP1LC3点状细胞的细胞中具有与核周聚集线粒体共定位的（C）细胞进行量化（B、C的两个独立实验中每组>150个细胞）。（D和E）Sesn2号机组+/+和赛斯2−/−用脂多糖（LPS）刺激BMDM（12 h），然后在有或无巴非霉素A的情况下进行ATP治疗1（D）MAP1LC3B-II的免疫印迹分析和（E）MAP1LC 3B-II免疫印迹强度的量化。（F-H）Sesn2号机组+/+和赛斯2−/−BMDM先用脂多糖（LPS）预处理（12 h），然后再进行ATP处理。（F） mt-mKeima的典型共焦免疫荧光图像。比例尺：25μm。（G） 高（550）比率的量化前任:438前任)信号面积（红色）与线粒体总面积之比（在2个独立实验中每组>30个细胞）和（H）线粒体形态学变化的透射电子显微镜（箭头，自噬体内的线粒体；箭头，受损的线粒体；红色“N”，细胞核）。NS，不显著。比例尺：1µm。所示数据代表了3个独立实验的结果，是平均值±s.e.m.*，p<0.05; ***,第页<0.005来自方差分析，随后是Tukey的事后检验。
图6。
图6。
SESN2通过增加ULK1蛋白水平诱导有丝分裂自噬活性。（A） 来自的指示蛋白质的免疫印迹分析序列2+/+和赛斯2−/−BMDM先用LPS（0、6和12小时）预处理，然后再进行ATP处理。（B） 免疫印迹分析用LPS（12 h）引发的BMDM细胞溶质（C）和线粒体（M）蛋白组分中的人类ULK1，然后进行ATP处理。（C-I）赛斯2−/−感染含逆转录病毒控制载体或人类ULK1表达载体的BMDM(赛斯2−/− +续，ses2−/− +分别用LPS（12 h）预处理ULK1，然后进行ATP处理。（C） 使用抗人ULK1抗体对人类ULK1进行免疫印迹分析，（D）GFP-MAP1LC3与TOMM20共定位的典型共焦免疫荧光图像，（E）量化总细胞中具有3个以上强GFP-MAP1 LC3点的细胞数量（在2个独立实验中，每组>150个细胞），流式细胞术检测BMDMs，（F）MitoSOX染色15分钟，（G）MitoTracker深红色和MitoTraker-Green染色15分钟；（H）免疫印迹分析显示的蛋白质；（I）ELISA测定的IL1B、IL18和TNF的产生。所示数据是3个独立实验的代表性数据，是平均值±s.e.m.***，第页<0.005来自方差分析，随后是Tukey的事后检验。
图7。
图7。
Sesn2在小鼠脓毒症模型中对感染性休克起保护作用。（A-D）CLP在Sesn2号机组+/+和赛斯2−/−老鼠。（A） ELISA法测定的血清IL1B和IL18（n=5），ELISA法测量的均质肺组织中的IL1B与IL18（n=5）；CLP术后24 h血清肌酐、GOT1和GPT（n=6）；以及Sesn2号机组+/+（n=11）只小鼠或赛斯2−/−（n=12）只小鼠。（E-G）CLP在Sesn2号机组+/+和赛斯2−/−老鼠。（E） 肝组织裂解物中SESN2的免疫印迹分析赛斯2−/−+Ad-Cont和赛斯2−/−+Ad-SESN2；'ns’表示非特异性带。（F） CLP手术后24小时通过ELISA测定血清IL1B和IL18（n=5），以及赛斯2−/−+Ad-Cont（n=13）或赛斯2−/−+Ad-SESN2（n=13）。（H和I）Sesn2号机组+/+和赛斯2−/−小鼠被脂多糖攻击。（H） LPS激发24小时后用ELISA测定血清IL1B和IL18（12 mg/kg，i.p.）和（i）Sesn2号机组+/+（n=13）只小鼠或赛斯2−/−（n=13）LPS激发后的小鼠（25 mg/kg，i.p.）。（（J）和K）赛斯2−/−+Ad-Cont和赛斯2−/−+用LPS攻击Ad-SESN2小鼠。（J） LPS激发24小时后（12 mg/kg，i.p.）和（K）生存期后通过ELISA测定的血清IL1B和IL18赛斯2−/−+Ad-Cont（n=13）或赛斯2−/−+LPS激发后的Ad-SESN2（n=13）小鼠（25 mg/kg，i.p.）。所示数据为平均值±s.e.m。生存率通过Kaplan-Meier log-rank检验进行分析。*，p<0.05; **,第页< 0.01; ***,第页<0.005来自方差分析，随后是Tukey的事后检验。
图8。
图8。
SESN2在脓毒症加重时升高，在脓毒病恢复时降低。（A和B）向小鼠注射LPS（0、24、48和96 h，每组9只）。（A） 用ELISA测定抗SESN2-Alexa Flour 488抗体和（B）血清IL1B和IL18染色的小鼠血单核细胞中SESN2的流式细胞术。所示数据是3个独立实验的代表性数据，是平均值±s.e.m.***，第页<0.005来自ANOVA和Tukey的事后检验。
图9。
图9。
人SESN2在感染性休克患者的单核细胞中高度表达。（A-D）从正常受试者（n=8）和感染性休克患者（n=9）采集人类血样。（A） 通过ELISA测定的血浆IL1B和IL18，（B）用抗CD14-FITC抗体染色的血液中分离的人单核细胞流式细胞术评估纯度，（C）用透射电镜观察分离的人外周血单核细胞（箭头，受损线粒体；红色‘N’，细胞核）中线粒体的形态变化。SESN2和考马斯蓝染色的比例尺、1µm和（D）免疫印迹分析，作为分离的人类单核细胞等负荷的对照。每个符号代表一个单独的主题。所示数据代表了2个独立实验和第页未成对学生的价值观t吨测试。
图10。
图10。
SESN2通过有丝分裂诱导维持线粒体内环境稳定，从而抑制NLRP3的长时间激活。在巨噬细胞中，SESN2（S2）蛋白在LPS和ATP刺激后12小时因NOS2增加而产生的NO增加。增加的SESN2通过调节2个同步事件诱导有丝分裂激活。首先，SESN2通过介导SQSTM1（SQ）的聚集及其与Lys63-泛素化（U）线粒体的结合来诱导线粒体启动。总之，有丝分裂是通过SESN2-和ULK1-介导的SESN2-SQSTM1启动的核周簇状线粒体选择性自噬来完成的，从而抑制炎症小体的长期激活。
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