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.2016年7月5日;113(27):E3921-30。
doi:10.1073/pnas.1605023113。 Epub 2016年6月22日。

HIV-1和HIV-2与HLTF和UNG2 DNA修复蛋白表现出不同的相互作用

附属公司

HIV-1和HIV-2与HLTF和UNG2 DNA修复蛋白表现出不同的相互作用

卡西亚·赫雷卡等。 美国国家科学院程序. .

摘要

HIV在非分裂宿主细胞中的复制发生在非标准dUTP、载脂蛋白B mRNA-editing、酶催化、多肽样3(APOBEC3)胞苷脱氨酶和SAMHD1(细胞周期调节的dNTP三磷酸水解酶)dNTP酶的高浓度存在下,这些酶在这些细胞中维持低浓度的标准dNTP。这些条件有利于将DNA损伤标记引入病毒cDNA,从而使其成为DNA修复酶处理的基础。在所有灵长类慢病毒中发现的副蛋白Vpr及其HIV-2/猴免疫缺陷病毒(SIV)SIVsm副logue Vpx劫持CRL4(DCAF1)E3泛素连接酶以缓解其中一些情况,但它们与DNA修复蛋白的相互作用程度尚未完全确定。在这里,我们确定HLTF,一种复制后DNA修复解旋酶,是HIV-1/SIVcpz Vpr蛋白的共同靶点。我们表明,HIV-1 Vpr重组CRL4(DCAF1)E3,以指导HLTF进行蛋白酶体依赖性降解,而不依赖于先前报道的Vpr与碱基切除修复酶尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG2)和交叉连接内切酶MUS81的相互作用,Vpr也通过CRL4。因此,HIV-1病毒的单独功能取代了CRL4(DCAF1)E3,以清除三条DNA修复途径中的关键酶。相反,我们发现HIV-2 Vpr不能有效地对HLTF或UNG2进行降解编程。我们的发现揭示了HIV-1和DNA修复机制之间的复杂相互作用,表明DNA修复在HIV-1生命周期中起着重要作用。HIV-1和HIV-2与DNA修复酶和SAMHD1的不同相互作用意味着这些病毒使用不同的策略来保护其基因组并促进其在宿主中的复制。

关键词:HIV;SAMHD1;Vpr;复制后DNA修复;限制。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图S1。
图S1。
在Vpr相关DNA修复蛋白中寻找Vpr下调的蛋白。(A类)CEM的细胞周期曲线。SS-iH1.iVpr和U2OS-iH1.iVpr细胞用多西环素处理24小时,或对照细胞用足叶乙甙(0.4μM,18小时)或诺可唑(100 ng/mL,18 h)培养。G1期、S期和G2/M期细胞的百分比分数显示在每个面板中。(B类)从中显示的细胞制备的全细胞提取物A类用所示蛋白的抗体进行免疫印迹。异步分裂细胞(用“A”表示)被用作附加控制。
图S2。
图S2。
HLTF在HIV天然靶细胞中表达。对从指定的人类白细胞群体制备的全细胞提取物进行HLTF、MUS81和TFIID负载对照的免疫印迹。
图1。
图1。
HIV-1 Vpr在G2期外耗尽HLTF。(A类)实验策略。携带指示的HIV-1 NL4-3 Vpr转基因的U2OS细胞通过双胸苷阻断同步化,然后在实验期间保持在G1/S边界。在第二次胸苷治疗期间,多西环素诱导HIV-1Vpr表达,并在指定的时间点收集细胞,用于细胞周期位置的FACS分析(B类)并对指示蛋白进行免疫印迹分析(C类). 转录因子II D(TFIID)被用作负荷对照。未进行双胸腺嘧啶核苷阻断的异步分裂细胞群的细胞周期曲线如所示B类并标有“A”。
图2。
图2。
HIV-1 Vpr消耗HLTF与细胞周期位置无关。(A类)通过细胞分选分离的G1、S和G2/M细胞群的纯度。通过DNA含量排序分离的U2OS(模拟)和U2OS-iH1.Vpr(HIV-1 Vpr)G1-、S-和G2/M期细胞的DNA图谱与父母非同步增长的未排序群体(标记为“A”)的DNA图谱重叠。(B类)用与HLTF、UNG2、MUS81、CyclinA2、FLAG-tagged Vpr和TFIID负载控制反应的抗体进行免疫印迹分析从异步分裂(“A”)、G1、S和G2/M群体制备的细胞提取物。星号表示α-UNG2抗体显示的非特异性背景带。
图S3。
图S3。
Vpr介导的HLTF和MUS81水平的耗竭与DNA损伤检查点反应的激活无关。U2OS-iH1.Vpr和亲代U2OS细胞在强力霉素(100 ng/mL)和咖啡因(0.75 mM,1.5 mM)存在下培养9 h或24 h(A类)用7AAD染色,用FACS或(B类)通过免疫印迹分析HLTF、MUS81、Vpr和TFIID负荷控制水平。
图3。
图3。
Vpr选择性地靶向RAD5的HLTF同源物,这种作用独立于与UNG2和MUS81的相互作用。(A类B类)HIV-1 Vpr耗竭HLTF、SHPRH、MUS81和UNG2的时间进程。U2OS-iH1.Vpr和对照细胞用多西环素处理,并通过免疫印迹分析在指定时间制备的细胞提取物。拉明B和TFIID提供了装载控制。(C类)HLTF、MUS81和UNG2水平没有相互调节。对U2OS细胞进行对照非靶向RNAi(scr)或靶向HLTF或MUS81的RNAi,并对细胞提取物进行HLTF、MUS81、UNG2和TFIID免疫印迹。
图4。
图4。
HIV-1Vpr将HLTF招募到CRL4的DDB1-DCAF1模块DCAF1公司蛋白酶体依赖性降解的E3复合物。(A类)Vpr针对HLTF进行蛋白酶体依赖性降解。用多西环素处理U2OS-iH1.Vpr细胞(HIV-1 Vpr)和对照U2OS细胞(模拟),或在没有或存在MG132蛋白酶体抑制剂(1μg/mL)的情况下处理9小时。免疫印迹法显示细胞裂解液中的HLTF、MUS81和Vpr水平。TFIID提供了加载控件。(B类)HIV-1介导的HLTF向CRL4的招募示意图DCAF1型E3复合物。表明HA和FLAG表位标签分别位于Vpr和HLTF上。(C类)Vpr将HLTF招募到CRL4的DCAF1-DDB1模块DCAF1公司E3复合物。FLAG-HLTF与myc标记的HIV-1 Vpr或Vpr瞬时共表达(H71R)如图所示,在HEK293T细胞中。免疫印迹法显示HLTF免疫复合物和洗涤剂提取物中存在内源性DCAF1、DDB1、异位Vpr和HLTF。
图5。
图5。
HIV-1 Vpr与HLTF的相互作用并不涉及这两种蛋白中的已知功能元件。(A类)HLTF突变及其对Vpr介导的HLTF水平下调的影响概述。HLTF蛋白和HLTF缺失突变体的示意图显示了HIRAN、RING、SNF2和不连续DEXDc和HELICc解旋酶域的位置。调节Vpr敏感性的HLTF区域被装箱。(B类)HIV-1 Vpr不作用于HLTF的已知功能域。FLAG-HLTF及其变体,如A类在HEK 293T细胞中,随着HA标记的HIV-1 Vpr剂量的增加,HLTF和Vpr暂时共存,免疫印迹显示细胞提取物中的HLTF与Vpr水平。α-管蛋白提供了一种负荷控制。(C类)HLTF水平的耗尽需要Vpr N末端。HIV-1 Vpr或Vpr(24R、36P)变异体在增加剂量时与HLTF共表达(上部)或UNG2(下部)在HEK293T细胞中,如前所述分析细胞提取物。(D类)E24R、R36P突变选择性地破坏Vpr与HLTF的结合。HA-Vpr及其变体在HEK 293T细胞中与FLAG-HLTF共表达。Vpr(H71R)不结合DCAF1的变异体被用作阴性对照。通过免疫印迹法在Vpr免疫复合物和洗涤剂提取物中揭示了内源性DCAF1、DDB1以及异位的Vpr和HLTF。
图S4。
图S4。
Vpr诱导的DCAF1和蛋白酶体依赖的HLTF降解的瞬时剂量依赖性分析。(A类)在HEK 293T细胞中,FLAG-HLTF与HIV-1 HA-Vpr瞬时共表达。细胞在有或无MG132(0.62μM,1.25μM)或乳酸菌素(2.5μM,5μM。(B类)HIV-1 Vpr消耗HLTF水平的能力需要与DCAF1结合。HIV-1Vpr(NL4-3)和两种变体Vpr对HLTF水平的影响(H71R)或Vpr(W54R)不结合DCAF1或不降解UNG2的,分别在瞬时共表达分析中进行测试。
图6。
图6。
HLTF和MUS81缺失对HIV-1 Vpr诱导的G2期阻滞的影响。(A类)Vpr(Vpr)(E24R、R36P)捕获G2期U2OS细胞。用多西环素[Dox(+)]或不[Dox[−)]诱导表达HIV-1 NL4-3 Vpr、Vpr的U2OS细胞的细胞周期谱(E24R、R36P),或Vpr(H71R)显示G1、S和G2期细胞的百分比,面板编号显示在右上角。横坐标是线性标度上显示的DNA含量。纵坐标是以对数标度表示的DNA合成(B类)HIV-1 Vpr逮捕U2OS。HLTF。KO细胞处于G2期。U2OS的细胞周期配置文件。HLTF中。用多西环素[Dox(+)]或不[Dox(−)]诱导KO细胞表达HIV-1 NL4-3Vpr 48小时(C类)Vpr阻止MUS81耗尽的U2OS和U2OS。HLTF。KO细胞处于G2期。亲代(模拟)U2OS(HLTF)和U2OS的细胞周期剖面示意图。HLTF。KO细胞(HLTF.KO)或其携带多西环素诱导的HIV-1 Vpr转基因(HIV-1 Vpr)的衍生细胞系。如图所示,用靶向MUS81(MUS81)或非靶向(scr)的siRNA转染并在2天后用多西环素诱导(或不诱导)的细胞。诱导后2天测定细胞周期曲线,并对G1、S和G2/M期细胞进行量化,如A类每个条形代表四个重复的平均结果。使用非配对双尾Student’st吨用韦尔奇修正进行测试(n个= 4; *P(P)< 0.05, **P(P)< 0.01, ***P(P)<0.001,以及****P(P)< 0.0001). 显示了三个独立实验的代表性结果。
图S5。
图S5。
RNAi介导U2OS和U2OS中MUS81的缺失。HLTF。KO电池(与图6相关)。U2OS[高级别飞行任务组(+/+)]和U2OS。HLTF。KO[HLTF公司(−/−)]对细胞进行靶向MUS81的RNAi,并通过免疫印迹分析全细胞提取物中的指示蛋白。
图7。
图7。
HLTF和UNG2被HIV-1和SIVcpz耗尽,但不被HIV-2 Vpr蛋白耗尽。(A类)主要HIV-1(M,N,O)、SIVcpz(Ptt,Pts)和HIV-2(A1,A2,B)组的Vpr蛋白的一致序列比对。序列以一个字母代码显示。将与HLTF(E24、R36)、UNG2(W54)和DCAF1(H71)结合所需的残留物装箱。(B类)HIV-1和SIVcpz Vpr对HLTF和UNG2进行降解编程。FLAG-HLTF或FLAG-UNG2与不断增加剂量的HA-epitope标记的HIV-1 Vpr蛋白暂时共存。免疫印迹法显示细胞提取物中HLTF和Vpr的水平。α-管蛋白提供负载控制。(C类D类)一致性HIV-2Vpr和Vpx蛋白不调节HLTF或UNG2水平。FLAG-HLTF或FLAG-UNG2与指示的HA-epitope标记的共识HIV-2 Vpr或Vpx蛋白共表达。如前所述,对HLTF、UNG2和Vpr/Vpx进行了分析。
图S6。
图S6。
共识HIV-2 Vpr和Vpx蛋白具有功能。(A类)共识HIV-2亚型A和B Vpr蛋白结合CRL4的内源性DDB1-DCAF1模块DCAF1公司E3复合物。共识HIV-2 HA-Vpr蛋白在HEK293T细胞中瞬时表达。使用HIV-1 NL4-3-Vpr及其不结合DCAF1的H71R取代的变体作为对照。免疫印迹法显示α-HA-Vpr免疫复合物和洗涤剂提取物中的内源性DCAF1、DDB1和异位Vpr。(B类)Vpx蛋白耗尽SAMHD1水平。HIV-2 HA-Vpr蛋白在HEK 293T细胞中与SAMHD1瞬时共表达。HIV-1 NL4-3 Vpr作为阴性对照平行表达。细胞在存在或不存在MG132蛋白酶体抑制剂(1μg/mL)的情况下培养过夜,通过免疫印迹法显示全细胞提取物中SAMHD1、Vpr、Vpx和α-微管蛋白负载控制水平。
图8。
图8。
HIV-1和HIV-2对HLTF和UNG2水平的发散效应。(A类B类)HIV-1感染会耗尽HLTF和UNG2水平。(A类)Jurkat T细胞感染HIV-1 VLP转补体(Vpr)或未感染HIV-1Vpr(HIV-1VLP;左侧)或单周期HIV-1 NL4-3.GFP。R(右)+(vpr+),或R(vpr)病毒(HIV-1;赖特). 免疫印迹法显示感染后48小时从受感染细胞和对照细胞(标记为“c”)制备的提取物中HLTF、UNG2和α-微管蛋白负载控制水平。(B类)HIV-1 VLP和HIV-1 NL4-3.GFP。R(右)+和R病毒用于A类经p24衣壳免疫印迹归一化。用α-HA抗体(HIV-1 VLP)或α-Vpr抗体(HIV-1)检测到Vpr。(C类)HIV-1耗尽初级CD4中的HLTF和MUS81+T细胞。CD4细胞+用α-CD3/α-CD28珠激活T细胞并用HIV-1 NL4-3.GFP转导。R(右)+(或R)感染后第2天通过细胞分选分离GFP阳性细胞,并通过免疫印迹分析指示蛋白的表达。对照CD4的两倍系列稀释液+全细胞裂解物提供了定量标准。(D类E类)HIV-1和HIV-2对HLTF和UNG2水平的发散效应。Jurkat T细胞感染HIV-1 NL4-3.GFP。R(右)+(HIV-1)或HIV-2 ROD,其完整的vpr和vpx基因表达RFP标记。感染后2天,FACS显示报告基因表达。横坐标为GFP/RFP荧光,以对数表示。纵坐标是以线性比例显示的前向散射(D类)免疫印迹法显示细胞提取物中的UNG2、SAMHD1、HLTF和Lamin B负载控制(E类). (F类G公司)THP-1细胞感染HIV-1 NL4-3.GFP。R(右)+[或R表达Vpr和Vpx(Vpr/Vpx)或仅表达Vpr[Vpr/(−)或未感染(标记为“c”)]的HIV-2 ROD(F类),或使用SIVmac251 VLP或SIVmac239(G公司)如图所示,并通过免疫印迹分析提取物。星号表示α-SAMHD1抗体显示的非特异性带。

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