Gypenoside L inhibits autophagic flux and induces cell death in human esophageal cancer cells through endoplasm reticulum stress-mediated Ca2+ release

doi:10.18632/oncotarget.10159

.2016年7月26日；7(30):47387-47402.

doi:10.18632/目标10159。

绞股蓝苷L通过内质网应激介导的Ca2+释放抑制食管癌细胞自噬流量并诱导细胞死亡

廖成辉¹, 郑凯^1 2, 阎丽^三, 洪旭⁴, 强融康¹, 长风扇¹, 胡晓鹏¹, 哲金¹, 曾勇^三, 孔晓丽¹, 张健（Jian Zhang）¹, 吴旭丽¹, 吴海强¹, 刘丽忠¹, 肖晓华⁵, 王一飞², 何振丹¹

附属公司

¹深圳大学药学系、医学院、深圳市新型天然保健品重点实验室、天然小分子药物创新平台、深圳市天然小分子创新药物工程实验室。
²暨南大学生命科学与技术学院，广州，中国。
^三昆明医科大学第一附属医院，中国昆明。
⁴深圳大学生命科学学院，深圳，中国。
⁵深圳大学医学院第一附属医院，深圳，中国。

采购管理信息： 27329722
预防性维修识别码：项目编号5216949
内政部： 10.18632/目标10159

绞股蓝苷L通过内质网应激介导的Ca2+释放抑制食管癌细胞自噬流量并诱导细胞死亡

廖成辉等。肿瘤靶点. 2016.

.2016年7月26日；7(30):47387-47402.

doi:10.18632/目标10159。

作者

附属公司

¹深圳大学药学系、医学院、深圳市新型天然保健品重点实验室、天然小分子药物创新平台、深圳市天然小分子创新药物工程实验室。
²暨南大学生命科学与技术学院，广州，中国。
^三昆明医科大学第一附属医院，中国昆明。
⁴深圳大学生命科学学院，深圳，中国。
⁵深圳大学医学院第一附属医院，深圳，中国。

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预防性维修识别码：项目编号5216949
内政部： 10.18632/目标10159

摘要

食管癌是世界上癌症死亡的主要原因之一。由于药物和辐射耐受性的增加，迫切需要开发新的抗癌药物来触发非凋亡细胞死亡以补偿凋亡抵抗。在本研究中，我们发现绞股蓝皂苷L（Gyp-L）（一种从绞股蓝中分离出来的皂苷）治疗可诱导人类食管癌细胞非凋亡性溶酶体相关细胞死亡。Gyp-L诱导的细胞死亡与溶酶体肿胀和自噬通量抑制有关。机制研究表明，通过增加细胞内活性氧（ROS）水平，Gyp-L触发蛋白质泛素化和内质网（ER）应激反应，导致钙从ER肌醇三磷酸受体（IP3R）操作的储存库释放，最终导致细胞死亡。有趣的是，在Ca2+释放和内质网应激之间存在一个对Gyp-L反应的相互正向调节环。此外，蛋白质合成对于Gyp-L-介导的内质网胁迫和细胞死亡至关重要。总之，这项工作通过诱导非常规ROS-ER-Ca2+介导的人类食管癌细胞死亡，为Gyp-L提供了一种新的治疗方案。

关键词：Ca2+释放；活性氧；自噬流量抑制；未折叠蛋白反应；真空化。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有潜在的利益冲突。

数字

**图1。Gyp-L诱导细胞死亡**
(A类)Gyp-L的化学结构(B类)Gyp-L抑制食管癌细胞的生长。ECA-109和TE-1细胞分别与递增剂量的Gyp-L孵育24小时、48小时和72小时。MTT法测定细胞活力。数据是至少三个独立实验的平均值±SD。(C类)用Gyp-L处理ECA-109和TE-1细胞24小时，并按照材料和方法中的描述测量培养基中的LDH活性。与总细胞裂解物的结果相比，坏死率为100%。10%乙醇处理细胞24小时的结果作为坏死阳性对照（P.C.）***P（P）*与对照组相比<0.01。(D类)用Gyp-L处理正常细胞HUVEC和HEEpiC细胞24 h，用MTT法测定细胞活力。

**图2。Gyp-L诱导的细胞死亡与溶酶体融合和肿胀**
(A类)Gyp-L处理诱导细胞质空泡化。用Gyp-L（60μg/ml）处理ECA-109或TE-1细胞不同时间。在显微镜下拍摄细胞形态（40倍放大）。比例尺：20μm。右侧面板显示了Gyp-L（60μg/ml）处理不同时间后ECA-109和TE-1细胞中具有可见空泡的细胞百分比的量化。(B类)在用Gyp-L（60μg/ml）处理指定时间之前，用LAMP1-GFP转染细胞24小时。(C类)用Gyp-L（60μg/ml）处理ECA-109细胞24 h，固定并用透射电镜检查。Gyp-L处理细胞图像的高倍放大显示溶酶体。比例尺：2μm。(D类)DAPI染色显示培养基和Gyp-L处理（12 h，60μg/ml）ECA-109细胞的细胞核。Gyp-L（60μg/ml）处理8至24小时后ECA-109和TE-1细胞核大小的量化。

**图3。Gyp-L诱导非凋亡细胞死亡**
(A类)Gyp-L按指定浓度处理24小时后，使用Annexin-V-FITC/PI染色的流式细胞术检测Gyp-L-对ECA-109细胞凋亡的诱导作用。在三个独立实验中获得了类似的结果。(B类–C类)Z-VAD（50μM）对Gyp-L诱导的细胞死亡和细胞质空泡形成的影响。比例尺：20μm。(D类)在有无NEC（20μM）的情况下，用Gyp-L处理ECA-109或TE-1细胞24小时。用MTT法测定细胞活力。

**图4。自噬参与Gyp-L诱导的细胞死亡**
(A类)用60μg/ml Gyp-L处理Gyp-LECA-109细胞诱导LC3-II蛋白表达的时间进程，并用western blot分析LC3-II和GAPDH的蛋白水平。(B类)用不同浓度的Gyp-L处理ECA-109和TE-1细胞，并对细胞裂解液进行p62和GAPDH的western blot分析。(C类)GFP-LC3打孔分析。将质粒GFP-LC3（2μg）转染ECA-109细胞24 h，然后再添加Gyp-L 12 h或24 h。通过荧光显微镜捕获图像，并测定每个细胞的GFP-LC3puncta平均数。在每个独立实验中，对来自5个代表性领域的至少50个细胞进行计数。比例尺：20μm。(D类)敲除自噬相关基因可防止Gyp-L诱导的细胞死亡。用siRNAs转染ECA-109细胞*生命周期3*,*自动液位计5*,*自动液位计7*或对照siRNA（N.C）24小时，然后用不同浓度的Gyp-L再处理24小时。MTT法测定细胞活力，western blot结果显示敲除效果。所提供的数据代表了三个独立的实验。

**图5。Gyp-L抑制自噬流量**
(A类)Gyp-L处理导致自噬底物p62的积累。用不同浓度的Gyp-L处理ECA-109和TE-1细胞，并对细胞裂解物进行western blot分析。(B类–C类)CQ（20μM）的加入提高了Gyp-L诱导的LC3-II和GFP-LC3穿孔的蛋白水平。(D类)用mRFP-GFP-LC3质粒（2μg）转染ECA-109细胞。转染后24小时，用60μg/ml Ro或20μM CQ或10μM雷帕霉素处理细胞12小时。然后固定细胞并进行共聚焦显微镜检查。比例尺：10μm。(E类)共焦显微镜显示LAMP2和LC3之间的共定位。用Gyp-L处理细胞24小时，固定，然后用抗LAMP2（红色）和抗LC3B（绿色）染色。

**图6。Gyp-L对蛋白质泛素化和UPR活化的影响**
(A类)Gyp-L依赖于时间和剂量增加泛素化蛋白的水平。ECA-109细胞用60μg/ml Gyp-L孵育指定时间，或用0、20、40、60和80μg/ml Gyp-L处理12 h，细胞裂解物进行western blot。(B类)Gyp-L以剂量和时间依赖的方式激活UPR通路。(C类–D类)TUDCA减弱Gyp-L介导的UPR通路激活和自噬通量抑制。在有或无TUDCA（40μM）的情况下，用Gyp-L（60μg/ml）处理ECA-109和TE-1细胞12 h，并用western blot分析细胞裂解产物。(E类)TUDCA保护癌细胞免受Gyp-L诱导的细胞毒性。在TUDCA存在或不存在的情况下，用Gyp-L处理24小时后，用MTT法测定细胞活力。所提供的数据代表了三个独立的实验。数据表示为三个独立实验的平均值±SD或标准误差。

**图7。钙²⁺内质网释放加速Gyp-L诱导的内质网应激和细胞死亡**
(A类)Gyp-L增加细胞内Ca²⁺浓度。用40、60或80μg/ml Gyp-L处理ECA-109细胞12小时或24小时，然后用5μM Fluo-4/AM培养细胞60分钟，并用荧光显微镜检测。左侧面板：代表性显微照片。右侧面板：钙的量化²⁺根据Fluo-4/AM荧光进行生产。数据以平均值±SD表示***P（P）*与对照组相比<0.01。(B类–C类)BAPTA-AM降低LC3-II和p62水平，并用Gyp-L（60μg/ml）在BAPTA-AM10μM存在或不存在的情况下处理ECA-109和TE-1细胞12 h，通过western blot分析细胞裂解产物。(D类)TUDCA还原Ca²⁺水平。Gyp-L和TUDCA处理12 h后，用Fluo-4/AM和细胞内Ca染色ECA-109细胞²⁺流式细胞仪检测。(E类)ER Ca的表达²⁺频道。(F类–我)2-APB还原Ca²⁺ER的释放、UPR途径的激活、LC3-II和p62的积累，以及Gyp-L诱导的细胞死亡。用或不用2-APB（20μM）处理细胞。用MTT法测定24小时处理后的细胞活力。

**图8。蛋白质合成参与Gyp-L诱导的内质网应激和细胞死亡**
(A类–B类)蛋白质印迹显示CHX对Gyp-L诱导的UPR通路激活和泛素化蛋白的影响。用Gyp-L（60μg/ml）在CHX（5μg/ml。(C类–D类)CHX逆转了Gyp-L对自噬通量抑制的抑制作用，并降低了Gyp/L对食管癌细胞的细胞毒性。

**图9。Gyp-L诱导的细胞毒性依赖于细胞内ROS的生成**
(A类–B类)在没有或存在NAC的情况下，测量Gyp-L诱导的细胞内ROS生成。ECA-109细胞经NAC（5 mM）或不经NAC处理12 h，然后用DCFH-DA（10μM）染色0.5 h。用流式细胞仪测定细胞内ROS。所提供的数据代表了三个独立的实验。(C类–E类)NAC显著逆转内质网应激的激活，Ca²⁺Gyp-L诱导的释放和自噬通量抑制(F类)阻断活性氧生成可消除Gyp-L的细胞毒性(**G公司**–小时)TEMPOL（2 mM）或Trolox（1 mM）对Gyp-L细胞毒性和Gyp-L-诱导Ca的影响²⁺释放。(我)LC3-II的过度表达改善了NAC介导的抑制。用GFP-LC3转染细胞24小时，然后用Gyp-L处理细胞24小时。

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