Microfluidic single-cell transcriptional analysis rationally identifies novel surface marker profiles to enhance cell-based therapies

doi:10.1038/ncomms11945

.2016年6月21:7:11945。

doi:10.1038/ncomms11945。

微流控单细胞转录分析合理识别新的表面标记谱以增强细胞治疗

附属机构

¹美国加州斯坦福大学医学院儿童再生医学哈奇实验室外科，邮编94305。
²美国加利福尼亚州斯坦福市斯坦福大学医学院生物医学信息学项目，邮编94305。
^三奥地利林茨约翰内斯·开普勒大学整形、美容和重建外科。
⁴德国慕尼黑工业大学整形外科和手外科。
⁵墨尔本大学外科，皇家墨尔本医院，300 Grattan St Parkville VIC 3068，Australia。
⁶美国加州斯坦福大学医学院系统医学部儿科，邮编94305。

采购管理信息： 27324848
PMCID公司：项目编号：C5512622
内政部： 10.1038/ncomms11945年

微流控单细胞转录分析合理识别新的表面标记谱以增强细胞治疗

罗伯特·伦内特等。国家公社. 2016.

.2016年6月21:7:11945。

doi:10.1038/ncomms11945。

附属机构

¹美国加州斯坦福大学医学院儿童再生医学哈奇实验室外科，邮编94305。
²美国加州斯坦福大学医学院生物医学信息学项目，邮编94305。
^三奥地利林茨约翰内斯·开普勒大学整形、美容和重建外科。
⁴德国慕尼黑工业大学整形外科和手外科。
⁵墨尔本大学外科，皇家墨尔本医院，300 Grattan St Parkville VIC 3068，Australia。
⁶美国加州斯坦福大学医学院系统医学部儿科，邮编94305。

采购管理信息： 27324848
PMCID公司：项目编号：C5512622
内政部： 10.1038/ncomms11945年

摘要

目前的祖细胞疗法只有适度的疗效，这限制了其临床应用。这可能是细胞异质性的结果，这种异质性减少了传递到病变组织的功能性祖细胞的数量，并阻止了潜在病理细胞群破坏的纠正。在这里，我们开发了一种通过单细胞转录分析和高级生物信息学鉴定表型不同的祖细胞亚群的高分辨率方法。当结合高通量细胞表面标记筛选时，该方法有助于合理选择表面标记，以前瞻性分离具有所需转录谱的细胞亚群。我们通过识别糖尿病状态下功能失调的祖细胞亚群，并在异基因应用后使糖尿病创面愈合率正常化，从而确立了该平台在昂贵且高度病态的糖尿病创面中的作用。我们相信，这项工作为靶向细胞治疗的发展提供了一个逻辑框架，可以根据任何临床应用进行定制。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有竞争性的经济利益。

数字

**图1。单细胞转录分析确定了一个假定具有增强再生潜能的人类ASC亚群。**
(一)对所有已知细胞SMs进行单细胞转录筛查，以识别那些具有差异表达的SMs（最适用于细胞亚型划分）。基因表达表现为中位数的倍数变化（黄色高表达，中位数以上32倍，蓝色低表达，中位以下32倍；灰色无表达）。(b)单细胞分析侧重于高拷贝数、差异分布的SM基因，确定了重复k均值聚类中存在的细胞亚群。(**c（c）**)线性判别分析（LDA）确定SM用于前瞻性亚群分离，ROC分析利用前向特征选择确定的“最佳”个体或基因组进行聚类敏感性和特异性。(d日)使用两种LDA定义的SM（DPP4和CD55）通过FACS对预期hASC亚群分离的单细胞确认。(**e（电子）**)hASC阳性亚群富集增强了与组织再生相关的多个基因的基因表达分布（通过Kolmogorov–Smirnov测试确定的选定受显著影响的基因）。(**（f）**)单细胞晶须图和混合细胞RT-PCR证实了在群体水平上选定的单细胞基因分布结果。(克)hASC阳性选择后，基于这些基因的得分最高的IPA构建的转录组网络显著增加。重要的“种子”基因被涂成红色，以区别于网络中剩余的“推断”实体。*表示*P（P）*通过单向方差分析，阳性选择与hASC或阴性选择之比≤0.05。误差条代表标准误差。

**图2。前瞻性hASC选择和共存对ASC亚群动态的影响，以告知细胞来源决策。**
(一,b)对转录鉴定的hASC亚群的富集提高了暴露于*在体外*凋亡刺激（Fas配体；测量caspase活化（红色））(**c（c）**,d日)增加细胞增殖和克隆性(**e（电子）**)延长干性标志物（CD34）的表达。(**（f）**,克)在糖尿病和衰老的单细胞分析中，经转录鉴定的ASC亚群显著减少，并具有关键信号通路的放松调节作用。基因表达表现为中位数的倍数变化（黄色高表达，中位数以上32倍，蓝色低表达，中位以下32倍；灰色无表达）。(小时)单个细胞（左）和基因（右）的主成分投影显示了表型之间的显著分离，主要由血管/组织重塑基因驱动。(我)健康、老年和糖尿病mASC的单细胞转录分析表明，在这些状态下簇1细胞的耗竭/功能障碍不是细胞SM丢失和重新分布到其他簇的结果（突出显示了亚群定义的SM和组织重塑基因的表达谱）。(j个)流式细胞术分析显示野生型伤口中动态DPP4/CD55亚群增加，支持其在伤口愈合过程中的作用。与未受损皮肤相比，糖尿病和老年伤口的DPP4/CD55亚群也升高，具有代偿性过度分泌的趋势，与细胞功能受损一致*表示*P（P）*通过单向方差分析或学生方差分析≤0.05t吨-测试（健康与老年人或糖尿病患者**（f）**; 第7天与中的相应控制j个).^∧表示*P（P）*≤0.05，通过Student’s进行正面和负面选择t吨-测试。误差条表示s.e.m比例尺，50 微米。

**图3。潜在ASC选择增强体内伤口愈合潜力。**
(一–**c（c）**)与未分类或阴性选择的细胞相比，将浓缩的mASC单次局部应用于糖尿病小鼠伤口显著加快伤口闭合率（通过数字摄影和连续伤口面积测量进行跟踪），基本上使糖尿病小鼠伤口愈合动力学正常化。(d日)将浓缩的mASC应用于糖尿病创面也能显著促进皮肤再生。(**e（电子）**)强化ASC支持旁分泌作用机制，在暴露于强化ASC条件培养基后，强化ASC显著上调成纤维细胞胶原基因表达，可能是通过增加生长因子表达(克). (**（f）**)尽管生长因子表达增强，但富含ASC的条件培养基对糖尿病伤口愈合的益处不如直接细胞应用(克)，强调了通过肝细胞疗法持续分泌细胞因子的重要性。(克)糖尿病ASC的富集并不能纠正生长因子缺陷，支持异体细胞的使用。对于伤口愈合曲线，*P（P）*通过单向方差分析≤0.05，表示为：^∧正选择与负选择；^$用于阴性选择与未分类单元格；^#阳性组与所有组比较；^¢用于阳性选择和无细胞对照。⁺表示*P（P）*所有比较的单向方差分析均<0.05*表示*P（P）*通过单向方差分析或学生方差分析≤0.05t吨-剩余数据测试（阳性与阴性选择和hASCe（电子）). 误差条代表s.e.m.比例尺，100 微米。

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1. Rennert R.C.等人，《皮肤创伤治疗的生物疗法：第三阶段和启动治疗》。专家操作。生物疗法。13, 1523–1541 (2013).-公共医学
1. Calafiore R.、Montanuci P.和Basta G.糖尿病患者胰腺β细胞替代用干细胞：实际观点。货币。操作。《器官移植》19，162–168（2014）。-公共医学
1. 临床试验.gov贝塞斯达：美国国家医学图书馆。可从以下位置获得：https://clinicaltrials.gov网站。2016年3月4日访问。
1. Lin C.S.，Xin Z.C.，Dai J.&Lue T.F.常用的间充质干细胞标记物和追踪标签：局限性和挑战。历史。组织病理学。28, 1109–1116 (2013).-项目管理咨询公司-公共医学
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[3] Calafiore R.、Montanuci P.和Basta G.糖尿病患者胰腺β细胞替代用干细胞：实际观点。货币。操作。《器官移植》19，162–168（2014）。-公共医学

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[5] 临床试验.gov贝塞斯达：美国国家医学图书馆。可从以下位置获得：https://clinicaltrials.gov网站。2016年3月4日访问。

[6] 临床试验.gov贝塞斯达：美国国家医学图书馆。可从以下位置获得：https://clinicaltrials.gov网站。2016年3月4日访问。

[7] Lin C.S.，Xin Z.C.，Dai J.&Lue T.F.常用的间充质干细胞标记物和追踪标签：局限性和挑战。历史。组织病理学。28, 1109–1116 (2013).-项目管理咨询公司-公共医学

[8] Lin C.S.，Xin Z.C.，Dai J.&Lue T.F.常用的间充质干细胞标记物和追踪标签：局限性和挑战。历史。组织病理学。28, 1109–1116 (2013).-项目管理咨询公司-公共医学

[9] Graf T.&Stadtfeld M.胚胎和成人干细胞的异质性。《细胞干细胞》3，480–483（2008）。-公共医学

[10] Graf T.&Stadtfeld M.胚胎和成人干细胞的异质性。《细胞干细胞》3，480–483（2008）。-公共医学

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