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.2016年11月；100(5):1113-1124.
doi:10.1189/jlb.3A1015-463R。 Epub 2016年6月16日。

抑制mTOR通过自噬非依赖性机制减少原代巨噬细胞中的脂毒性细胞死亡

李贺 1 2, 卡斯桑德拉·韦伯 1 2, 阿比纳夫·迪万 1 2, 乔尔·德·席林 三 2 4
附属公司

mTOR的抑制通过自噬非依赖性机制减少原代巨噬细胞中的脂毒性细胞死亡

李贺等。 白细胞生物学杂志. 2016年11月.

摘要

肥胖和糖尿病患者的巨噬细胞功能障碍与持续炎症和不良伤口愈合反应有关。与这些表型相关，我们之前已经证明，在高脂肪环境中巨噬细胞激活通过涉及溶酶体损伤的机制导致细胞死亡。在寻找这种反应所需的信号通路时，我们发现mTOR抑制剂，托林和雷帕霉素，对初级腹腔巨噬细胞中的脂毒性细胞死亡具有保护作用。mTOR抑制的保护作用也通过遗传功能丧失方法得到了证实。鉴于mTOR在调节自噬中的重要性，我们假设该途径在保护细胞免受死亡方面很重要。我们首先证明，由于溶酶体功能受损，自噬被棕榈酸酯和LPS破坏。相反，mTOR抑制剂torin增加巨噬细胞自噬并保护其免受溶酶体损伤；然而，都灵的有益作用在自噬缺陷细胞中持续存在。mTOR的抑制也触发了TFEB的核定位，TFEB是一种调节溶酶体生物发生和功能的转录因子，但拯救表型并不需要TFEB存在。相反，我们证明mTOR抑制降低线粒体氧化代谢，并减弱棕榈酸酯对LPS诱导的线粒体呼吸的负面影响。这些结果表明，mTOR的抑制通过一种涉及减轻线粒体底物超载的自噬非依赖性机制对脂质毒性起保护作用。基于这些发现，我们认为，减少巨噬细胞mTOR活化的治疗可以防止营养过剩状态下的功能失调性炎症，如糖尿病。

关键词：TFEB；TLR；糖尿病；溶酶体；新陈代谢。

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数字

图1。
图1.mTOR抑制剂保护巨噬细胞免受脂毒性细胞死亡。
（A） 用250μM棕榈酸酯（palm）或BSA±50 ng/ml LPS处理pMAC，并在载体（veh；白色条）或100 nM torin（黑色条）存在的情况下，用annexin-PI流式细胞术评估细胞死亡。（B） pMAC与BSA-PBS或palm-LPS在veh（白色条）、100 nM雷帕霉素（rapa；灰色条）或100 nM torin（黑色条）存在下孵育，并通过annexin-PI流式细胞术在30 h内测定细胞死亡。（C） 用棕榈脂-LPS或硬脂酸盐（硬脂酸；100μM）-LPS结合血管或都灵刺激巨噬细胞，并用膜联蛋白-PI流式细胞术定量细胞死亡。（D） 在指定条件下通过蛋白质印迹对S6K和AKT磷酸化的动力学分析。（E） 在veh、rapa或torin存在的情况下，用PBS或LPS刺激pMAC 4 h，并通过Western blotting评估S6K和AKT磷酸化。条带的密度定量显示在斑点下方。nd，未确定。条形图报告平均值±东南方至少进行3次试验，每次试验一式三份*P（P）<0.05，车辆vs.抑制剂。
图2。
图2基因mTOR功能丧失可减轻初级巨噬细胞中的脂毒性细胞死亡。
（A） 用PBS或LPS（50 ng/ml）刺激无Cre（Cre-neg）、1拷贝LysM-Cre（CRX1）或2拷贝LysC-Cre（CreX2）的mTOR flx/flx小鼠的pMACS 4 h，并用Western blotting分析S6K和AKT的磷酸化。条带的密度定量显示在斑点下方。用BSA-PBS或palm-LPS刺激不含Cre（白色条）、1份LysM-Cre（灰色条）或2份LysC-Cre（黑色条）的（B和C）mTOR flx/flx pMACs，并通过annexin-PI流式细胞术在30小时（B）或24小时（C）释放LDH来量化细胞死亡。（D） 与LysM-Cre（raptorKO）杂交的对照或猛禽漂浮小鼠的巨噬细胞被LPS刺激4 h，并通过Western blotting评估S6K磷酸化。（E） 通过控制手掌LPS刺激WT或raptorKO巨噬细胞，通过LDH释放确定细胞死亡。在LPS（F）或棕榈LPS（G）存在的情况下，用载体（veh）、10μM S6K抑制剂（S6Ki；浅灰色条）或20μM S6Ki（深灰色条）处理（F和G）pMACs，并分别通过Western印迹或膜联蛋白PI流式细胞术评估S6磷酸化或细胞死亡。谱带的密度定量显示在斑点下方。ND，未确定。条形图报告平均值±东南方至少进行3次试验，每次试验一式三份*P（P）对于WT和mTOR KO管线，<0.05。
图3。
图3：棕榈酸盐存在时LPS激活会削弱自噬流量。
（A） 按照指示刺激pMACs 16小时+2小时溶媒与50 nM巴非霉素（BAF），以评估自噬流量。通过Western blotting分析LC3的表达。（B） 如图所示刺激巨噬细胞，并在指定时间点使用定量RT-PCR评估LC3和p62 mRNA的表达。用BSA-PBS（C）、BSA-LPS（D）、palm-PBS（E）或palm-LPS（F）刺激（C-F）pMAC，并用免疫荧光显微镜分析p62蛋白。条形图报告平均值±东南方至少进行3次试验，每次试验一式三份*P（P）PBS与LPS相比<0.05；#P（P）BSA与手掌相比<0.05。比例尺，25μm。
图4。
图4脂质应激巨噬细胞中GFP-LC3溶酶体清除受损。
（A和B）GFP-LC3巨噬细胞用巴非霉素（BAF）刺激PBS、LPS或LPS 6 h，并用流式细胞术定量GFP荧光。显示了三份样品（B）的代表性直方图（A）和条形图。（C） GFP-LC3 pMAC用PBS（白条）或LPS（黑条）处理6h，用定量RT-PCR检测GFP mRNA表达。按照指示刺激（D和E）GFP-LC3 pMAC 6或16小时，并通过流式细胞术评估LC3-GFP的表达。显示了16 h（E）时三份样品的代表直方图（D）或条形图。用BSA-LPS或palm-LPS±BAF处理（F和G）GFP-LC3巨噬细胞16 h，并用流式细胞仪测定GFP荧光。显示了代表性直方图（F）或三份样品的柱状图（G）。车辆、车辆。条形图报告平均值±东南方至少进行3次试验，每次试验一式三份*P（P）PBS与LPS的差异<0.05；#P（P）BSA与手掌相比<0.05。
图5。
图5：用都灵抑制mTOR刺激原代巨噬细胞的自噬。
（A） pMAC用载体（veh）或托林±巴非霉素（BAF）处理，并通过蛋白质印迹评估LC3和p62蛋白的表达。（B和C）GFP-LC3巨噬细胞用veh或torin±BAF处理6 h，然后用流式细胞仪进行GFP定量。图中显示了具有代表性的直方图（B）和三重样本条形图（C）。（D–G）经指示刺激处理的pMAC中GFP-LC3的免疫荧光显微镜。谱带的密度定量显示在斑点下方。条形图报告平均值±东南方至少进行3次试验，每次试验一式三份。#P（P）<0.05，车辆与城市比例尺，50μm。
图6。
图6通过mTOR抑制拯救脂毒性细胞死亡与自噬无关。
（A） 用BSA-PBS或palm-LPS±torin处理WT和ATG5KO pMACs，用annexin-PI流式细胞术检测细胞死亡。（B） 用BSA-PBS或palm-LPS±torin处理WT和ATG16LKO pMACs，用annexin-PI流式细胞术检测细胞死亡。（C） 用BSA-PBS或palm-LPS±torin处理WT和p62 KO pMACs，并用annexin-PI流式细胞术检测细胞死亡。对于每只KO小鼠，分离总蛋白并通过Western blotting分析p62±LC3。车辆。条形图报告平均值±东南方至少进行3次试验，每次试验一式三份*P（P）BSA-PBS vs.palm-LPS<0.05；#P（P）<0.05，车辆vs.都灵。
图7。
图7：都灵对脂毒性巨噬细胞死亡的保护作用不需要TFEB。
（A） 在存在（右）或不存在（左）托林的情况下，用BSA-PBS或棕榈LPS刺激pMACs，并通过流式细胞术评估赖氨酸蛋白酶受体红染色。Lysotracker红色低细胞群体由黑色显示的门定义。（B和C）条形图定量溶血酶原标记红低染色细胞，来自经载体（veh）或都灵（B）处理的WT巨噬细胞，或来自mTOR flx/flx Cre阴性小鼠和mTOR flx/flx-LysM-Cre双阳性（mTOR KO）小鼠的巨噬细胞（C）。（D） 用veh、torin或LPS处理pMACs 2 h，然后分离蛋白并进行细胞溶质（cyto）与核（nuc）分离。通过Western blotting评估TFEB分布和分馏控制[微管蛋白（tub）用于胞浆，层粘连蛋白B（lamB）用于细胞核]。（E） 细胞用veh或torin处理2 h，然后用TFEB抗体（红色）染色并通过荧光显微镜成像。Hoechst核复染（蓝色）覆盖在下部面板的TFEB染色上。（F） 用对照（con）或TFEB特异性siRNA池转染pMAC，并用palm-LPS±torin刺激。蛋白敲除程度如插图所示。（G） 通过在未通透细胞上使用荧光偶联抗体对表面LAMP1进行染色，然后对平均荧光强度（MFI）进行流式细胞术定量，来评估都灵对溶酶体胞吐的影响。条形图报告平均值±东南方至少进行3次试验，每次试验一式三份*P（P）BSA-PBS vs.palm-LPS<0.05；#P（P）<0.05，车辆与城市比例尺，75μm。
图8。
图8 mTOR抑制调节巨噬细胞线粒体代谢。
（A和B）OCR通过Seahorse Bioscience通量分析仪在基线检查时和注射氟羰基环核苷酸苯肼（max）或鱼藤酮/抗霉素（rot/ant）后，在载体（veh；A）或torin（B）存在下刺激巨噬细胞16小时后评估。（C） pMACS在存在veh或torin的情况下刺激16 h，糖酵解速率通过ECAR使用Seahorse Bioscience代谢通量分析仪进行估算。（D） 用PBS或LPS刺激pMAC，并在基线和注射指定的代谢抑制剂[UK5099（丙酮酸）；依托莫西（eto；FA氧化）；BPTES（谷氨酰胺）]后测量线粒体OCR（总OCR−非线粒体OCR）。（E） 在存在veh或指示的代谢抑制剂的情况下，用palm-LPS处理巨噬细胞，并通过LDH释放评估细胞死亡。雷帕霉素。条形图报告平均值±东南方至少进行3次试验，每次试验一式三份*P（P）BSA-PBS vs.palm-LPS或veh vs.抑制剂<0.05；#P（P）<0.05，车辆vs.都灵。
图9。
图9巨噬细胞脂肪毒性中mTOR信号的模型。
作为对TLR4刺激的反应，mTOR被激活，这导致多种底物的线粒体代谢增强。这是细胞活化的一个重要事件，可导致细胞因子生成和脂质合成增加。当出现过量SFA（如棕榈酸酯）时，mTORC1仍会激活，但下游线粒体对高能底物的使用受到抑制，可能导致有毒代谢物的积累和/或细胞信号的中断。底物进入和线粒体使用的不平衡可能导致溶酶体病理和巨噬细胞死亡。
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