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.2016年6月17:6:28083。
doi:10.1038/srep28083。

一种新的TP53通路影响HGS介导的大肠癌外体形成

孙玉林 1, 郑伟伟 2, 郭正光 三, 强菊 1, 林竹 4, 佳佳高 1, 周兰平 1, 刘芳（音） 1, 杨旭 1, 詹启敏（Qimin Zhan） 1, 周志祥 5, 孙伟（音译） 三, 赵晓航 1
附属公司

一种新的TP53通路影响HGS介导的大肠癌外体形成

孙玉林等。 科学代表. .

摘要

肿瘤衍生的外泌体对细胞间通讯很重要。然而，TP53在控制结直肠癌（CRC）外泌体生成中的作用尚存在争议且不明确。对HCT116 TP53野生型（WT）、TP53敲除型（KO）和构建的TP53（R273H）突变型（MT）细胞分泌的外泌体的特征进行了评估。与WT细胞相比，MT和KO细胞的外泌体显示出显著减小的大小。使用等压标记相对和绝对定量（iTRAQ）-2D-LC-MS/MS策略对外体蛋白进行了全面的蛋白质组学分析。共鉴定出3437个含有≥2个匹配肽的蛋白质组。具体而言，肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物（HGS）在MT和KO细胞的外泌体中持续下调。功能研究表明，低HGS水平是外显子大小减小的原因。TP53调节HGS的表达，从而调节HGS-依赖性外体的形成。此外，HGS表达随着大肠癌的发生而逐渐增加，是一个独立的不良预后因素。总之，在CRC中发现了一种新的HGS依赖的TP53外体形成机制。HGS可作为一种新的预后生物标志物和治疗干预的候选靶点。

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数字

图1
图1。从HCT116细胞中纯化的外显子TP53型状态显示出不同的大小。
(A类)野生型无血清条件培养基中分离的全细胞裂解物（WCL）和囊泡的Western blot分析TP53型（重量），TP53型（R273H）突变体（MT）和TP53型-空（KO）HCT116细胞。检测外泌体标志物HSP70、CD63和CD9以及线粒体蛋白BNIP3。实验至少进行了三次。(B类)WT、MT和KO细胞外泌体的电子显微照片。阴性图像表明，外泌体呈现出光滑的碟状形态。比例尺为100 纳米。(C类)根据电子显微图像计算200个外泌体的平均直径分布，并绘制所示大小的外泌物频率。(D类)通过NanoSight颗粒追踪分析从三组中分离出的外显子的代表性大小分布。
图2
图2。3437个定量外体蛋白的生物信息学分析和Western blotting验证。
(A类)基于基因本体注释的显著丰富的细胞成分分析饼图。含有<0.3%总蛋白的分类被归类为杂项（Misc.）。(B类)基于基因本体注释的生物过程分析饼图。(C类)维恩图显示了我们的iTRAQ-2D-LC-MS/MS策略确定的蛋白质的存在、缺失或重叠，以及之前从8项蛋白质组学研究中获得的2489种CRC细胞外体蛋白。根据这些已知的2489种蛋白质的识别数量，将其分为8类，范围从n到n = 1到n = 8.识别的计数越高，可靠性越高。(D类)差异表达外体蛋白的Western blotting验证。进行密度测定以量化每个通道，并在每个印迹下显示整个细胞裂解液中每个蛋白质与负载控制β-肌动蛋白或外显子中CD63的比率，WT细胞中的比率为参考值。根据我们的定量蛋白质组学结果，CD63的表达在三种外泌体类型中相对一致，因此在本研究中它被用作外泌物部分的负载控制。具有代表性的考马斯蓝染色SDS-PAGE凝胶如补充图S3所示。结果表明，这三种制剂中的外体蛋白水平相当。
图3
图3。HGS缺失导致较小的外泌体。
(A类)用蛋白质印迹法确认不同细胞系外显子中的HGS水平。使用考马斯蓝染色SDS-PAGE凝胶作为加载控制。(B类)Western blotting检测野生型全细胞裂解液中HGS蛋白水平TP53型（重量），TP53型（R273H）-突变体（MT）和TP53型-空（KO）HCT116细胞。β-actin作为内部对照。(C类)实时PCR检测HGS公司WT、MT和KO细胞中的mRNA水平**P（P） < 0.01; ***P（P） < 0.001. (D类)HCT116细胞中HGS的敲除与拯救。用慢病毒将pLKO.1-shHGS或模拟对照质粒稳定转染HCT116细胞。在拯救实验中，通过pCMV6-Myc-DDK-HGS质粒转染，HGS在HCT116-shHGS细胞中体外表达。β-肌动蛋白作为内部对照。(E类)HGS敲低（HCT116 shHGS）、HGS回收（HCT116 shHGS HGS）和模拟对照细胞分泌的外泌体中HGS水平的蛋白质印迹检测。使用考马斯蓝染色SDS-PAGE凝胶作为加载控制。(F类)从所示组收集的无血清条件培养基中分离出的外泌体的代表性电子显微照片。比例尺，100 纳米；直接放大，120000x。(G公司)根据电子显微图像计算200个外泌体的平均直径分布，并绘制指示大小的外泌物频率。（H） 各组外泌体大小分布的统计分析。n个 = 每组200个外泌体***P（P） < 0.0001. (我)通过NanoSight颗粒追踪分析从指定组中分离出的外显子的代表性大小分布。
图4
图4。HGS转录表达与TP53型TCGA结肠癌RNA-Seq数据集中的状态。
在加州大学圣克鲁斯分校的基因组浏览器数据库（UCSC，hg19）中，HGS基因有两个转录本，即uc002kbg.3和uc010wus.2。前一个转录本包含主要转录本，其在CRC中的平均丰度是uc010wus的350倍以上。此外，TP53基因有13个转录本。Uc002gij.3是主要的全长变体，而其他转录物在CRC中几乎不表达。因此，我们基于uc002kbg.3和uc002gij.3进行了这些分析。(A类)HGS mRNA在结肠腺癌患者的肿瘤组织中显著上调（n = 392）与相邻的非肿瘤组织（n = 38). *P（P） < 0.05. (B类)配对结肠腺癌和非肿瘤组织（n = 38），观察到相同的趋势*P（P） < 0.05. (C类)对于两种病理类型的结肠癌，腺癌组织中HGS mRNA水平显著升高（n = 392）与粘液腺癌（n = 62). ***P（P） < 0.0001. (D类)在结肠腺癌中TP53型该基因在130例患者中得到验证。HGS mRNA水平在TP53型突变组（MT，n = 29）与野生型组（WT，n = 101). *P（P） < 0.05. (E类)TP53突变结肠腺癌患者的Kaplan-Meier曲线（n = 48). (F类)野生型TP53结肠腺癌患者的Kaplan-Meier曲线（n = 68). (G公司)所有结肠腺癌患者的Kaplan-Meier曲线（n = 273）。对数秩检验在(E–G公司).
图5
图5。HGS蛋白在人CRC标本中的表达及临床病理特征。
(A类)正常大肠粘膜（a）、管状腺瘤（b）、邻近非肿瘤组织（c、e）和CRC肿瘤（d、f）中HGS表达的代表性免疫组织化学图像（x200倍放大）。(B类)免疫组织化学法测定正常大肠粘膜中HGS水平的分布（n = 4） 管状腺瘤（n = 11） 、邻近的非肿瘤组织和匹配的CRC肿瘤（n = 235）组。短红线代表每组的中值。绿色虚线表示阳性染色的阈值。(C类)HGS阴性和阳性CRC患者的Kaplan-Meier曲线。进行对数秩检验。(D类)235例CRC患者HGS表达的临床病理特征分析。短红线代表每组的中值***P（P） < 0.0001; *P（P） < 0.05. (E类)角色示意图TP53型在CRC的胞外体生产中。野生型TP53型刺激HGS的高水平表达。作为MVB分选的关键分子，HGS识别并随后将货物引导至内腔。在其他ESCRT复合物的配合下，成熟的MVB包含若干ILV，这些ILV与质膜形成并融合以释放其ILV，称为外泌体。然而，当TP53型在密码子273（R273H）处缺失或突变，HGS表达降低。在这种情况下，依赖HGS的ILV形成被抑制。存在包含均匀较小ILV的放大MVB。HGS对于维持外泌体的大小和控制其成分是必要的。
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