Stromal fibroblasts derived from mammary gland of bovine with mastitis display inflammation-specific changes

doi:10.1038/srep27462

.2016年6月7:6:27462。

doi:10.1038/srep27462。

乳腺炎牛乳腺基质成纤维细胞显示炎症特异性变化

陈青（音）¹, 何桂良¹, 张文耀¹, 童旭¹, 洪亮琪¹, 李静（音译）¹, 张勇（音）^1 2, 明清膏^1 2

附属机构

采购管理信息： 27272504
PMCID公司：项目经理4895242
内政部： 10.1038/srep27462

乳腺炎牛乳腺基质成纤维细胞显示炎症特异性变化

陈青（音）等。科学代表. 2016.

.2016年6月7:6:27462。

doi:10.1038/srep27462。

作者

陈青（音）¹, 何桂良¹, 张文耀¹, 童旭¹, 洪亮琪¹, 李静（音译）¹, 张勇（音）^1 2, 高明清^1 2

附属机构

¹西北农林科技大学兽医学院，陕西杨凌712100。
²西北农林科技大学农业部动物生物技术重点实验室，陕西杨凌712100。

采购管理信息： 27272504
PMCID公司：项目经理4895242
内政部： 10.1038/srep27462

摘要

成纤维细胞是乳腺基质细胞的主要成分，在牛乳腺的发育和退化中起着关键作用；然而，这些细胞是否与乳腺炎有关尚不清楚。因此，我们对从患有临床乳腺炎的牛乳腺中提取的炎症相关成纤维细胞（INF）和从因哺乳期间腿部骨折而屠宰的奶牛中提取的正常成纤维细胞进行了生物学和分子表征。利用体外共培养模型研究了INF对正常上皮细胞的功能贡献。我们提供证据表明，INF是活化的成纤维细胞，并表现出炎症相关特征。此外，INFs显著抑制上皮细胞的增殖和β-酪蛋白分泌，上调上皮细胞中肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-8的表达。这些发现表明，乳腺炎期间，牛乳腺内的基质成纤维细胞可能发生功能改变，这表明基质成纤维在牛乳腺炎及其治疗中的重要性。

PubMed免责声明

数字

**图1。收集具有代表性的乳腺组织样本，提取成纤维细胞和上皮细胞。**
**（A）**如文中所述，通过肉眼检查区分正常乳腺组织和乳腺炎乳腺组织。Φ：盘子的直径。**（B）**苏木精-伊红（H&E）染色证实了正常乳腺组织和乳腺炎组织的典型病理外观。**（C）**从组织中分离出的正常成纤维细胞（NF）、炎症相关成纤维细胞和上皮细胞通过相控显微镜和波形蛋白或细胞角蛋白免疫染色进行检测；细胞核用DAPI染色。NFs和INFs表现出相同的长梭形形态、波形蛋白表达和细胞角蛋白阴性染色。相比之下，上皮细胞呈现鹅卵石样外观，细胞角蛋白阳性表达，波形蛋白阴性表达。所有代表性图像均来自三个独立重复实验中的一个。

**图2。NF和INF的基本特征比较。**
**（A）**NF和INF在透射电子显微镜下的图像。**（B）**使用细胞计数试剂盒-8，在培养后指定的几天内，对96-well培养板中相同密度的NF和INF进行细胞增殖检测。使用公式（OD）计算细胞增殖率_n个− 外径₀)/外径₀× 100（OD，培养后指定天数的光密度值；n，培养天数）。与NF相比，INF表现出更高的增殖率*P（P） < 0.01与NF。**（C）**常规收集生长到汇合处的NF和INF，用Annexin/PI染色和流式细胞术检测细胞凋亡。绘制凋亡细胞的百分比，并且在NFs和INF中观察到相似的凋亡率。**（D）**通过蛋白质印迹分析成纤维细胞活化蛋白（FAP）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）在NFs和INFs中的表达。INF表达的FAP和α-SMA水平高于NFs。**（E）**使用ELISA试剂盒测定，与NF相比，NF分泌的白细胞介素6（IL6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）增加*P（P） < 0.01与NF。对NF和INF的混合细胞进行三次测量，所有数据均代表三次独立重复实验中的一次。

**图3。RNA-Seq基因表达导致NF和INF。**
**（A）**维恩图显示了NF和INF之间共表达基因和独特基因的数量。**（B）**NFs和INF之间共同表达基因的散点图。蓝色表示下调基因，橙色表示上调基因，棕色表示根据FDR标准与NF相比INF中的非调控基因 < 0.001和绝对对数₂（Y/X） > 1（C）显示INF与NF之间差异表达基因和非调节基因数量的直方图。

**图4。KEGG富集结果散点图。**
Rich因子是该路径项注释的差异表达基因数与该路径项中注释的所有基因数的比率。富因子越大，途径富集程度越高。Q值是从0到1的校正p值，较低的值表示路径更丰富。

**图5。差异基因表达模式的聚类分析。**
热图显示了20个ECM重塑相关差异表达基因（DEG）的表达水平**（A）**，42个与细胞连接和局部粘附相关的DEG（B）和39种免疫反应相关的二甘醇**（C）**.随机选择19个DEG，并通过实时PCR进一步确认其表达水平。每个样品测量三次，数据代表三个独立重复实验中的一个**（D）**.

**图6。INF对上皮细胞增殖、凋亡和炎症相关因子表达的影响。**
**（A）**与间接共培养模型中的NFs相比，INF抑制了上皮细胞的增殖。使用由DMEM/F12、0.5%FBS和抗生素组成的最低血清培养基（MSM）作为对照*P（P） < 0.01与NFs和对照相比。数据来自三个独立的实验。**（B）**上皮细胞在INFs条件培养基（CM）、NFs-CM和MSM中培养时显示出相同的凋亡率。绘制了凋亡细胞的百分比，数据来源于一式三份的典型实验。**（C）**Western blot分析检测β-酪蛋白的表达。与NFs共培养的上皮细胞相比，与NFs共同培养的上皮上皮细胞表达的β-酪蛋白水平较低。**（D）**采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白质印迹分析（Western blot analysis）检测TNF-α、IL6和IL8的表达水平。结果表明，INF上调了白细胞介素8（IL8）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达，但不影响IL6在上皮细胞中的表达。混合细胞分三次测量，所有数据均代表三次独立重复实验中的一次。所有代表性图像均来自三个独立重复实验中的一个。

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[1] Zhao X.和Lacasse P.牛乳腺炎期间的哺乳动物组织损伤：原因和控制。《动物科学杂志》86，57–65（2008）。-公共医学

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[7] Connor E.E.等人。卵巢类固醇对牛乳腺基因表达的调节。《乳品科学杂志》90补遗1，E55–65（2007）。-公共医学

[8] Connor E.E.等人。卵巢类固醇对牛乳腺基因表达的调节。《乳品科学杂志》90补遗1，E55–65（2007）。-公共医学

[9] 施密特·G·H·泌乳生物学。342–460B（美国旧金山：WH Freeman ft Co，1971）。

[10] 施密特·G·H·泌乳生物学。342–460B（美国旧金山：WH Freeman ft Co，1971）。

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