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.2016年6月1日;36(22):5933-45.
doi:10.1523/JNEUROSCI.4401-15.2016。

初级神经元自噬的隔室特异性调节

附属公司

初级神经元自噬的隔室特异性调节

桑德拉·马代等。 神经科学. .

摘要

自噬是维持神经元内环境稳定和防止轴突退化的重要降解途径。初步观察表明,自噬在神经元中是受空间调控的,但自噬是如何在不同的神经元隔室中调控的尚不清楚。通过对小鼠海马神经元的活细胞成像,我们建立了在基础条件下以及对营养剥夺诱导的应激反应下的组成性自噬的分区特异性机制。我们发现,在稳定状态下,细胞体包含来自不同神经室的自噬体群体,并由成熟状态和动力学的差异定义。轴突自噬体进入体细胞,并局限于体细胞内。这种分隔可能通过与富含胞体的蛋白水解活性溶酶体融合而促进货物降解。相比之下,在体细胞内产生的自噬体流动性较小,并且倾向于聚集。令人惊讶的是,饥饿并没有诱导轴突或躯体软骨细胞的自噬。虽然饥饿会显著降低神经元中的mTORC1信号,但这种减少不足以激活自噬。此外,Torin1对雷帕霉素哺乳动物靶点的药理抑制也不足以显著上调神经元自噬。这些观察结果表明,与其他细胞类型的发现相反,神经元自噬的主要生理功能可能不是在饥饿时动员氨基酸和其他生物合成构件。相反,神经元中的结构性自噬可能通过平衡合成和降解来维持细胞内稳态,特别是在远离躯体的远端轴突过程中。

重要性声明:自噬是神经元中一个重要的稳态过程,但神经元特异性机制尚不清楚。在这里,我们比较了神经元隔室中的自噬体动力学。轴突自噬是一种从远端轴突向胞体输送货物的载体过程。然而,体细胞包含不同成熟状态的自噬体,包括从轴突接收的输入与局部生成的自噬体相结合。一旦进入体细胞,自噬体就被限制在体细胞内,有助于货物降解和生物合成构件再循环至蛋白质合成的主要位点。神经元自噬并没有因饥饿或哺乳动物雷帕霉素抑制靶点而强烈上调,这表明神经元中的结构性自噬通过在调节神经元蛋白质组质量中发挥整体作用来维持体内平衡。

关键词:LC3;自噬;轴突运输;海马神经元;mTOR;索马。

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数字

图1。
图1。
轴突、LAMP1阳性自噬体通过AIS进入体细胞,并被限制在体树突结构域。A类,海马神经元,生长8 DIV,发育轴突和树突过程。用mCherry-LC3和YFP-NaVII-II(AIS标记物)转染神经元。箭头表示自噬小泡。B类mCherry-LC3在AIS中运动的Kymography。为了清楚起见,追踪了mCherry-LC3测时仪,如下所示;灰色框表示AIS区域。C类GFP-LC3和LAMP1-RFP在中轴索和近轴索运动的Kymograph分析。闭合箭头表示沿着中轴索与LAMP1-RFP结合的逆行自噬体,并进入LAMP1-RF阳性的胞体。开放箭头表示GFP-LC3阴性的LAMP1-RFP阳性细胞器。D类,年分析的电影中产生的沿中轴突的静止图像C类闭合箭头表示LAMP1-RFP阳性的自噬体。开放的紫色箭头表示仅对LAMP1-RFP阳性的细胞器。E类对GFP-LC3转基因海马神经元10 DIV进行LAMP1免疫染色。闭合箭头表示轴突中内源性LAMP1阳性的自噬体。开放箭头表示GFP-LC3阴性的内源性LAMP1阳性细胞器。F类10 DIV生长的海马神经元轴突底部自噬体运动的时间序列。箭头表示GFP-LC3阳性自噬小体被拒绝进入轴突。G公司自噬体运动进入8 DIV生长的海马神经元树突的时间序列。箭头表示GFP-LC3阳性自噬小体强烈进入树突轴。H(H),自噬体从每个轴突群(轴突,n个=来自3个实验的6个神经元的12个事件;树枝晶,n个=来自5个实验的15个神经元的51个事件;5-10 DIV)。树突的值被低估了,因为自噬体超出了视野。比例尺:水平,5μm;垂直,1分钟。
图2。
图2。
体细胞包含来自不同成熟阶段不同腔室的自噬体。A类6 DIV海马神经元胞体自噬体生物发生的时间序列。箭头表示新形成的自噬小体。比例尺,1μm。B类固定10个DIV生长的GFP-LC3转基因海马神经元,并对GFP和p62进行免疫染色。箭头表示具有GFP-LC3阳性结构的细胞,这些结构对p62呈共同阳性。下面板是与非转基因神经元共培养的GFP-LC3转基因神经元(10DIV);p62阳性簇的存在并不依赖于GFP-LC3的表达。C类对生长于10 DIV的GFP-LC3转基因海马神经元进行GFP、p62和LAMP1免疫染色。相应的行扫描显示在右侧;箭头表示重叠的荧光强度峰值。D类,8个表达GFP-LC3和LAMP1-RFP的DIV海马神经元的活细胞成像静息。所示为两个单独细胞的顶端和基底平面以及相应的线扫描分析。基础图像上的闭合箭头表示GFP-LC3和LAMP1-RFP均呈阳性的细胞器。彩色点状物可能会因连续捕捉图像而出现轻微偏移,绿色之后是紫色。箭头在线扫描表示重叠荧光的峰值。GFP-LC3基底图像上开放的白色箭头表示未转染LAMP1-RFP的相邻轴突中的自噬体。E类在生长于8 DIV的两个不同海马神经元的顶面或基面上获得的GFP-LC3电影的第一帧和相应的整个帧的最大投影。单个自噬体被彩色编码,以在最大投影中可视化整个轨迹。比例尺:B–E类,5微米。
图3。
图3。
自噬并不是在氨基酸饥饿时沿着轴突上调的。A类,GFP-LC3转基因海马神经元(8 DIV)活细胞成像的Kymographys。为了清楚起见,GFP-LC3轨迹被追踪并显示在每个相应的日程表下面。比例尺:水平,5μm;垂直,1分钟。B类、中轴索自噬体密度定量(第一帧每100μm轴突自噬体数)(平均值±SEM;n个=5-6个实验中的23–32个神经元;8–10 DIV;用Dunnett的单因素方差分析事后(post-hoc)测试)。C类,定量中轴索自噬体面积通量(每100μm/min自噬体数)(平均值±SEM;n个=5-6个实验中的23–33个神经元;8–10 DIV;用Dunnett的单因素方差分析事后(post-hoc)测试)。D类中轴突逆行运输自噬体的定量(平均值±SEM;n个=5-6个实验中的23–33个神经元;8–10 DIV)*第页≤ 0.05; ***第页≤0.001(使用Dunnett的单向方差分析事后(post-hoc)测试)。E类,沿着海马神经元中轴突的自噬体运动的定量(平均值±SEM;n个=5-6个实验中的23–33个神经元;8–10 DIV)*第页≤ 0.05; ***第页≤0.001(Dunnett’s的单向方差分析事后(post-hoc)在指定的每个分组内进行测试x个-轴断裂)。ns,不显著;AVs,自噬空泡。
图4。
图4。
葡萄糖缺乏不会诱导自噬体的形成,但会破坏轴突的逆行运输。A类,沿着海马神经元8 DIV的中轴突的DsRed2有丝分裂的正视图和相应的kymograph。逆行方向向右。比例尺:水平,5μm;垂直,1分钟。B类8 DIV海马神经元轴突线粒体运动的定量(平均值±SEM;n个=2个实验中的13–17个神经元;Bonferroni的双向方差分析事后(post-hoc)测试)。C类、中轴索自噬体密度定量(第一帧每100μm轴突自噬体数)(平均值±SEM;n个=3–4个实验中的27–32个神经元;8–9 DIV;用Dunnett的单因素方差分析事后(post-hoc)测试)。D类,定量中轴索自噬体面积通量(每100μm/min自噬体数)(平均值±SEM;n个=3–4个实验中的27–33个神经元;8–9 DIV;用Dunnett的单因素方差分析事后(post-hoc)测试)。E类中轴突逆行运输自噬体的定量(平均值±SEM;n个=3–4个实验中的12–18个神经元;8–9 DIV)***第页≤0.001(使用Bonferroni的双向方差分析事后(post-hoc)测试)。ns,不显著;AVs,自噬空泡。
图5。
图5。
巴非霉素A1处理后,自噬体在胞体中积聚。A类,最大投影z(z)-GFP-LC3转基因海马神经元(8-10 DIV)的胞体堆叠。在插图中,海马神经元也显示出较大的GFP-LC3簇。比例尺,5μm。B类对表达GFP-LC3的海马神经元进行p62免疫染色。比例尺,5μm。C类GFP-LC3面积归一化为体面积的定量(平均值±SEM;n个=5-6个实验中的24-36个神经元;8–10 DIV)***第页≤0.001(使用Dunnett的单向方差分析事后(post-hoc)测试)。D类GFP-LC3面积归一化为体面积的定量(平均值±SEM;n个=30-33个神经元,来自3-4个实验;8–9 DIV;用Dunnett的单因素方差分析事后(post-hoc)测试)。E类,来自培养的海马神经元的裂解物的免疫印迹的定量。LC3-II水平标准化为GAPDH(平均值±SEM;n个=3个实验;SDS-PAGE和免疫印迹在每个实验中重复进行,8–10 DIV)***第页≤0.001(使用Dunnett的单向方差分析事后(post-hoc)测试)。F类,培养海马神经元裂解物的免疫印迹分析,用于内源性LC3和GAPDH(负荷控制)。G公司,对培养的野生型海马神经元裂解物进行免疫印迹分析,以检测mTORC1活性。Alpha-tubulin负荷控制显示在每个相应的免疫印迹下面。H(H),、免疫印迹分析和Torin1处理的培养野生型海马神经元裂解液中LC3-II水平的相应定量。LC3-II水平归一化为GAPDH(平均值±SEM;n个=3个实验;8–10 DIV)*第页≤0.05**第页≤0.01(使用Dunnett的单向方差分析事后(post-hoc)测试)。Calnexin和α-微管蛋白分别作为pS6和总S6免疫印迹的负荷控制。J,神经元自噬的室特异性调节的模型示意图。ns,不显著。

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引用人

工具书类

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