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.2016年5月31日：6:26876。
doi:10.1038/srep26876。

平滑激动剂减少人免疫缺陷病毒1型在人源化小鼠中诱导的血脑屏障破坏

维尔·辛格 1, 米拉·V·辛格 1, 桑蒂·戈兰特拉 2, 拉里萨·波卢科托娃 2, Sanjay B Maggirwar公司 1
附属公司

平滑激动剂减少人免疫缺陷病毒1型诱导的人源化小鼠血脑屏障破坏

维尔·辛格等。 科学代表. .

摘要

人类免疫缺陷病毒1型（HIV）相关的神经认知障碍的特征是活化/感染的白细胞通过破坏的血脑屏障（BBB）进入中枢神经系统，导致持续的神经炎症。在本报告中，使用人源化NOD/scid-IL2Rγc（null）小鼠来确定受损的Sonic hedgehog（Shh）信号与BBB功能丧失和神经损伤相关，并且调节Shh信号可以缓解这些有害影响。检测血浆病毒载量、p24水平和CD4（+）T细胞，作为生产性HIV感染的标志物。这些小鼠还表现出对伊文思蓝染料的排斥作用减弱，S100B（一种星形细胞蛋白）的血浆水平升高，紧密连接蛋白Occludin和Claudin5的下调，共同表明BBB功能障碍。此外，HIV（+）小鼠的脑组织显示突触密度降低、神经元萎缩、小胶质细胞激活和星形细胞增多。重要的是，在这些小鼠中还观察到Shh和Gli1的表达减少，表明Shh信号减弱。给药Shh模拟平滑激动剂（SAG）恢复了BBB的完整性，也减轻了感染小鼠的神经病理学。总之，我们的结果表明Shh信号在HIV感染中具有神经保护作用，强调了SAG在控制HAND发病机制方面的治疗潜力。

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数字

图1
图1。人源化小鼠的进展性HIV感染。
(一)人类CD34+细胞重建、HIV感染和观察时间框架的实验方案。(b）HIV感染者（N = 每组每个时间点3个）***表示P < 0.0001与基线时CD4+T细胞百分比相比(c）10 w.p.i.（N）的HIV蛋白p24 ELISA = 每组4个）。
图2
图2。HIV感染导致血小板活化。
(a）ELISA法测定人源化小鼠血浆人PF4水平（N = 每组4个）。(b）用流式细胞术（N = 每组每个时间点8个）。(c）尾出血试验在10 w.p.i.（N = 每组7人）。(d）血小板缺失小鼠（N = 4） 暴露于Tat（1.5 μg/g体重），并用流式细胞术测定GFP+单核细胞（来源于CX3CR1/GFP TG小鼠）向中枢神经系统的迁移。如图所示，血小板减少小鼠中Tat诱导的GFP+单核细胞向中枢神经系统的迁移被完全阻断*表示P < 0.05，***表示P < 0.0001.
图3
图3。HIV感染会破坏BBB的完整性。
（a）)采用伊文思蓝法测定血脑屏障通透性（N = 每组5只）10 w.p.i。在620℃的外径下，在HIV感染小鼠的大脑中检测到较高浓度的Evans蓝色染料 纳米。(b）在HIV感染小鼠的外周血血浆中检测到更高水平的S100B，一种中枢神经系统驻留蛋白（10w.p.i，N = 每组3人）。(c（c）,d）大脑石蜡切片（5 μm厚），用抗Claudin5（红色）标记，用DAPI（蓝色）复染标记细胞核。图像是在60倍（物镜放大）的条件下拍摄的，并将其光学放大至3倍。比例尺为10 微米。通过将校正后的积分密度除以三个随机视野的总成像面积，测量Claudin 5的相对强度。这些值是使用ImageJ软件获得的。观察到感染小鼠血管内皮细胞Claudin5表达降低。(e（电子）,（f）)对脑裂解物进行免疫印迹分析（N = 每组3个，10w.p.i.）显示在HIV感染的大脑中另一种紧密连接蛋白Occludin的缺失。使用Image J软件进行密度测定分析。
图4
图4。HIV感染导致人源化小鼠的神经病理学改变。
大脑石蜡切片（5 μm厚）获得10 w.p.i.，并用(一,b条)抗GFAP（红色），星形胶质细胞活化标记物。皮层区域的图像是在40倍下拍摄的。(c（c）,d日)抗Iba1（绿色），小胶质细胞激活标记物。图像是在60倍下拍摄的。使用ImageJ软件的“粒子分析”工具从三个随机视野对GFAP+和Iba-1+细胞进行计数。(e（电子）,（f）)抗-MAP2（红色）、抗NeuN（绿色）神经元标记物。图像以60倍的倍数拍摄，光学放大至3英寸(f）.↑表示树枝状串珠，方框中的截面表示树枝状变薄。所有切片用DAPI（蓝色）进行复染，以标记细胞核。比例尺为10 微米。(克–我)免疫印迹显示从HIV感染和未感染的人源化小鼠（N = 每组3个）。使用Image J软件进行密度测定分析。
图5
图5。平滑激动剂（SAG）拯救BBB完整性。
(a）用SAG或载体（N = 每组3-5人）。(b）ELISA法检测血浆S100B蛋白水平（N = 每组3个）*表示P < 0.05和***表示p < 0.0001. (c（c）–（f）)大脑石蜡切片获得10 w.p.i（5 μm厚）用抗Claudin5（红色）或抗Gli1（红色）标记，并用DAPI（蓝色）复染以标记细胞核。Claudin5和Gli1分别以60倍和40倍的倍率拍摄图像，并将其光学放大至3倍。比例尺为10 微米。通过将校正后的积分密度除以从三个随机视野成像的总面积，测量Claudin 5和Gli-1的相对强度。这些值是使用ImageJ软件获得的。图像显示SAG处理的小鼠的脑内皮细胞中Claudin 5和Gli1的表达增加。(g）HBEC接受Tat治疗（100 nM）带或不带SAG（500 nM）24 h.Gli1表达的RT-PCR图谱表明，Tat治疗导致Gli1的表达减少，并且可以通过SAG治疗进行挽救（N = 3).
图6
图6
SAG抑制星形胶质细胞活化(a、 b）大脑石蜡切片获得10 w.p.i（5 μm厚）用抗GFAP（红色）、星形胶质细胞活化标记物标记，并用DAPI进行复染。图像是以40倍的速度拍摄的。比例尺为10 微米。使用ImageJ软件的“粒子分析”工具从三个随机视野对GFAP+细胞进行计数。SAG处理导致GFAP表达细胞数量减少。(c）用Tat（100 nM）是否存在SAG（500 nM，牛顿 = 4） 24小时 h.流式细胞术检测GFAP表达*表示p < 与未处理细胞相比为0.05#表示p < 与Tat处理的细胞相比，0.05。(d）用ELISA检测血浆HIV p24蛋白水平（10 w.p.i.，N = 每组4个）。(e）来自健康供体的PBMC感染HIV-GFP 3天，并用SAG或DMSO治疗3天以上（N = 5） 。流式细胞术检测CD4+GFP+细胞。
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