O-Linked N-Acetylglucosamine (O-GlcNAc) Transferase and O-GlcNAcase Interact with Mi2β Protein at the Aγ-Globin Promoter

doi:10.1074/jbc.M116.721928

.2016年7月22日；291(30):15628-40.

doi:10.1074/jbc。M116.721928。 Epub 2016年5月26日。

O-连接N-乙酰氨基葡萄糖（O-GlcNAc）转移酶和O-GlcNA酶在Aγ-Globin启动子处与Mi2β蛋白相互作用

附属公司

¹来自生物化学和分子生物学系。
²IntelligeneDx癌症基因组学，堪萨斯州奥拉西，邮编66061。
^三药理学、毒理学和治疗学。
⁴波士顿大学医学院生物化学系和生物医学质谱中心，马萨诸塞州波士顿02118，和。
⁵来自生殖健康和再生医学研究所生物化学和分子生物学系、解剖学和细胞生物学系以及癌症中心，以及kpeterson@kumc.edu。
⁶来自堪萨斯州堪萨斯城堪萨斯大学医学中心生物化学和分子生物学系、癌症中心、生殖健康和再生医学研究所和阿尔茨海默病中心，邮编66160，cslawson@kumc.edu。

PMID： 27231347
预防性维修识别码：项目经理4957047
内政部： 10.1074/jbc。116.721928南非兰特

O-连接N-乙酰氨基葡萄糖（O-GlcNAc）转移酶和O-GlcNA酶在Aγ-Globin启动子处与Mi2β蛋白相互作用

Zhen Zhang先生等。生物化学杂志. 2016.

.2016年7月22日；291(30):15628-40.

doi:10.1074/jbc。M116.721928。 Epub 2016年5月26日。

附属公司

¹来自生物化学和分子生物学系。
²IntelligeneDx癌症基因组学，堪萨斯州奥拉西，邮编66061。
^三药理学、毒理学和治疗学。
⁴马萨诸塞州波士顿市波士顿大学医学院生物化学系和生物医学质谱中心，邮编：02118。
⁵来自生殖健康和再生医学研究所生物化学和分子生物学系、解剖学和细胞生物学系以及癌症中心，以及kpeterson@kumc.edu。
⁶来自堪萨斯州堪萨斯城堪萨斯大学医学中心癌症中心生物化学和分子生物学系，生殖健康和再生医学研究所，阿尔茨海默病中心，邮编66160，cslawson@kumc.edu。

PMID： 27231347
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摘要

γ-珠蛋白基因沉默的一种模式涉及一个GATA-1·FOG-1·Mi2β阻遏物复合物，该复合物结合到相对于（a）γ-珠基因帽位点的-566 GATA位点。然而，这种阻遏物复合体如何在-566 GATA位点组装的机制尚不清楚。在这项研究中，我们证明了O-连接的N-乙酰葡糖胺（O-GlcNAc）加工酶，O-GlcNAc转移酶（OGT）和O-GlcNAcase（OGA），在-566-GATA阻遏物位点与（A）γ-珠蛋白启动子相互作用；然而，GATA位点突变为GAGA显著降低了β-珠蛋白基因座酵母人工染色体（β-YAC）骨髓细胞中OGT和OGA启动子的相互作用。当用OGA抑制剂Thiamet-G处理WTβ-YAC骨髓细胞时，OGT、OGA和Mi2β在（A）γ-珠蛋白启动子的占有率增加。此外，当γ-珠蛋白在怀孕后第E18天E18人β-YAC转基因小鼠胎肝中受到抑制时，（A）γ-珠蛋白质启动子处的OGT和Mi2β募集增加。此外，我们发现Mi2β被O-GlcNAc修饰，OGT和OGA都与Mi2β、GATA-1和FOG-1相互作用。总之，我们的数据表明O-GlcNAcylation是γ-珠蛋白基因调控的一种新机制，它通过调节启动子内-566 GATA基序的GATA-1·FOG-1·Mi2β阻遏物复合体的组装来介导。

关键词：CHD4；雾；GATA转录因子；球蛋白；O-GlcNAc-转移酶；O-GlcNA酶；O-GlcNA酰化；O-连接N-乙酰氨基葡萄糖（O-GlcNAc）；翻译后修饰；转录。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
**OGT和OGA与^A类CID依赖性β-YAC BMC中的γ-珠蛋白启动子。** 一WT CID依赖性β-YAC BMC具有正常的GATA基序，该基序与GATA-1·FOG-1·Mi2β阻遏物复合物结合，介导γ-珠蛋白阻遏；而−566突变CID依赖性β-YAC BMC具有T→核苷酸−566的G点突变，减轻γ-珠蛋白抑制。b条用qPCR分析WT和−566突变的β-YAC BMC中γ-珠蛋白mRNA的水平。小鼠HPRT被用作内部对照。*c（c）*，整体*O（运行）*-通过免疫印迹分析WT和−566突变CID依赖性β-YAC BMCs的总细胞裂解物中的GlcNAc水平以及OGA和OGT蛋白表达。肌动蛋白被用作加载控制。d日分别对WT和−566突变的β-YAC BMC进行OGT和OGA ChIP分析。ChIP DNA通过qPCR进行分析，使用一组引物靶向该基因的−566 GATA位点^A类γ-珠蛋白启动子。正常兔子(卢比)IgG作为阴性对照。所有实验均至少进行了三次生物复制（*表示第页<0.05，学生t吨测试）。*误差线*代表S.E。*工作分解结构*，Western blotting。

**图2。**
**OGT、OGA和Mi2β在^A类TMG处理后WTβ-YAC BMC的γ-珠蛋白基因启动子。** 一，整体*O（运行）*-采用免疫印迹法分析对照组和TMG处理4天的WTβ-YAC BMC细胞总细胞裂解液中GlcNAc水平以及OGA和OGT蛋白的表达。GAPDH被用作负荷控制。b条用qPCR分析对照组和TMG处理4天的WTβ-YAC BMC细胞γ-珠蛋白mRNA水平。小鼠HPRT被用作内部对照。OGT/OGA(*c（c）*)和Mi2β(d日)分别对对照组和4天TMG处理的WTβ-YAC BMC细胞进行ChIP分析。ChIP DNA通过qPCR进行分析，使用一组引物靶向该基因的−566 GATA位点^A类γ-珠蛋白启动子。正常兔IgG作为阴性对照。所有实验均采用四个生物复制品（*表示第页<0.05，学生的t吨测试）。*误差线*代表S.E。*工作分解结构*，Western blotting。

**图3。**
**OGT和OGA与^A类γ-珠蛋白启动子在β-YAC转基因小鼠胎肝发育中的作用。**Mi2β(一)、OGT(b条)和OGA(*c（c）*)使用受孕后E12（γ-珠蛋白表达）和E18（γ-珠蛋白抑制）胎肝单细胞悬浮液进行ChIP测定，该悬浮液由β-YAC转基因小鼠胚胎制备。ChIP DNA通过qPCR进行分析，使用一组引物靶向该基因的−566 GATA位点^A类γ-珠蛋白启动子。正常兔IgG作为阴性对照。所有实验都是用至少三个生物复制品进行的。*误差线*代表S.E。

**图4。**
**NaB诱导后K562γ-珠蛋白表达增加。**用NaB处理K562细胞4天。每天收集细胞。一用qPCR检测NaB诱导前后γ-珠蛋白mRNA水平。b条，整体*O（运行）*-通过免疫印迹分析总细胞裂解物中的GlcNAc水平以及OGA和OGT蛋白表达。肌动蛋白被用作加载控制。OGA公司(*c（c）*)和OGT(d日)用qPCR检测NaB诱导前后的mRNA水平。人类HPRT被用作所有qPCR分析的内部对照。所有实验均至少进行了三次生物复制（*表示第页<0.05，学生的t吨测试）。*误差线*代表S.E。*工作分解结构*，Western blotting。

**图5。**
**Mi2β被修饰*O（运行）*-GlcNAc公司。** 一,*O（运行）*-GlcNAcylated蛋白通过*O（运行）*-NaB诱导前后K562细胞中的GlcNAc特异性抗体（CTD 110.6）(*顶部面板*)或H-H感应(*底部面板*); 用Mi2β抗体进行杂交。b条NaB诱导前后K562细胞免疫沉淀Mi2β蛋白(*顶部面板*)或H-H感应(*底部面板*); 用CTD 110.6检测印迹。*c（c）*和d日，从K562细胞中免疫沉淀Mi2β蛋白，并用CTD 110.6进行印迹检测(*c（c）*)或CTD 110.6预培养500 m米GlcNAc公司(d日).e（电子）从K562细胞中免疫沉淀Mi2β蛋白并用己糖胺酶处理*内容提供商*37°C下NagJ持续3小时；用CTD 110.6检测印迹。OGA抑制剂TMG用于增加总体*O（运行）*-GlcNAc水平。同种免疫沉淀（正常小鼠IgM或兔IgG）和抗体单克隆免疫沉淀(1°）作为阴性对照。所有实验都是用至少三个生物复制品进行的。*工作分解结构*，Western blotting。

**图6。**
**Mi2β与OGT相互作用。** 一和b条，在NaB诱导前后，在K562细胞中用OGT特异性抗体（AL-34）免疫沉淀OGT(一)或氯化血红素和HMBA诱导(b条)用Mi2β抗体进行杂交。*c（c）*和d日NaB诱导前后K562细胞免疫沉淀Mi2β蛋白(*c（c）*)或氯化血红素和HMBA诱导(d日)用OGT抗体进行杂交。OGA抑制剂TMG用于增加*O（运行）*-GlcNAc水平。同种免疫沉淀（正常兔或小鼠IgG）和抗体沉淀(1°）作为阴性对照。所有实验都是用至少三个生物复制品进行的。*工作分解结构*，Western blotting。

**图7。**
**Mi2β与OGA相互作用。** 一和b条，在NaB诱导前后，使用OGA特异性抗体在K562细胞中免疫沉淀OGA(一)或氯化血红素和HMBA诱导(b条)用Mi2β抗体进行杂交。*c（c）*和d日NaB诱导前后K562细胞免疫沉淀Mi2β蛋白(*c（c）*)或氯化血红素和HMBA诱导(d日)用OGA抗体进行杂交。OGA抑制剂TMG用于增加总体*O（运行）*-GlcNAc水平。同种免疫沉淀（正常鸡IgY或兔IgG）和抗体单克隆免疫沉淀(1°）作为阴性对照。所有实验都是用至少三个生物复制品进行的。*工作分解结构*，Western blotting。

**图8。**
**OGT和OGA与MEL中的GATA-1和FOG-1相互作用比拉细胞。** 一，使用MEL中GATA-1特异性抗体免疫沉淀GATA-1比拉细胞，用OGA和OGT抗体检测印迹。b条，FOG-1从MEL免疫沉淀比拉细胞，并用OGT和Mi2β抗体探测印迹。*c（c）*，OGA从MEL中免疫沉淀比拉细胞，用FOG-1抗体进行印迹。采用同型（IgY或IgG）免疫沉淀法和抗体免疫沉淀法（不含裂解物）作为阴性对照。所有实验均采用三个生物复制品进行。*工作分解结构*，Western blotting。

**图9。**
**GATA-1·FOG-1·Mi2β介导的OGT/OGA调控机制^A类γ-珠蛋白阻遏。** 一,*O（运行）*-GlcNAc公司(*G公司*)Mi2β上的循环由OGT和OGA处理。潜在地，*O（运行）*-GlcNAcylated Mi2β被招募到^A类γ-珠蛋白启动子与OGT和OGA通过GATA-1和FOG-1。b条，一次*O（运行）*-GlcNAcylated Mi2β被招募到启动子，其他潜在的辅因子(*蓝色椭圆形*与“？”）一起被招募到启动子中以形成稳定的阻遏物复合体，抑制^A类γ-珠蛋白转录。*c（c）*，何时^A类γ-珠蛋白转录被激活，Mi2β不与OGT或其他辅因子相互作用，OGA去除*O（运行）*-来自Mi2β的GlcNAc，分解阻遏物复合物。

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