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.2016年7月;64(7):425-40.
doi:10.1369/0022155416649579。 Epub 2016年5月24日。

一种用于组织形态学和分子应用的缓冲醇基固定剂

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一种用于组织形态学和分子应用的缓冲醇基固定剂

坎迪斯·佩里等。 组织化学与细胞化学杂志. 2016年7月.

摘要

福尔马林固定石蜡包埋组织(FFPE)是诊断性组织病理学评估的主要准备材料,越来越成为进行分子诊断的生物样本。然而,福尔马林具有致癌性,会导致蛋白质交联、核酸刻痕和改变。替代固定剂,包括70%乙醇,改善了生物分子的完整性;然而,它们尚未取代中性缓冲福尔马林(NBF)。在此,我们描述了磷酸盐缓冲乙醇70%(BE70)固定剂。BE70固定组织的组织形态学与NBF非常相似;然而,它是一种非交联固色剂,缺乏甲醛基固色剂的致癌性。从固定在BE70中的组织中分离的RNA的质量和数量显著高于从福尔马林固定的组织中回收的RNA的质量和数量。此外,基于实时聚合酶链反应分析结果,与NBF固定剂相比,BE70固定剂显示出优异的RNA和DNA完整性。免疫组织化学染色与试验抗原相似。总之,从石蜡包埋组织的生物分子回收率和质量来看,BE70是一种非交联固定剂,优于NBF和70%乙醇。需要进行额外的研究来比较组织形态学和免疫组织化学在临床环境中的表现和效用。

关键词:RNA完整性;酒精;固定;福尔马林;组织形态学;石蜡包埋;实时RT-PCR;组织。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益:作者声明,与本文的研究、作者身份和/或出版有关的以下潜在利益冲突:美国国立卫生研究院已就本文所述固定剂提交临时专利申请(62/255030)。佩里女士、钟博士和休伊特博士被列为本专利申请的发明人;然而,由于工作是根据合同(C.P.)或公务(J.-Y.C.和S.M.H.)进行的,因此该申请被分配给美国卫生与公众服务部(U.S.Department of Health and Human Services)。

数字

图1。
图1。
不同固定剂对小鼠肾脏的组织形态学评价。小鼠肾脏组织切片经70%缓冲乙醇(BE70)(A)、中性缓冲福尔马林(NBF)(B)、70%乙醇(E)(C)、70%酒精+0.5×PBS(EP)(D)、70%醇+1%甘油+0.5×PBS(EGP)(E)或70%乙醇+0.5%冰醋酸+0.5×EBS(EAP)(F)固定后,苏木精伊红(H&E)染色。比例尺,20µm。缩写:PBS,磷酸盐缓冲盐水。
图2。
图2。
70%缓冲乙醇(BE70)和中性缓冲福尔马林(NBF)固定的比较。BE70或NBF固定后,用苏木精和伊红(H&E)对组织切片进行染色。肝脏(A)、胰腺(B)、脾脏(C)、十二指肠(D)、心脏(E)、肺(F)、大脑(G)和皮肤(H)的H&E图像。比例尺,50µm。
图3。
图3。
70%缓冲乙醇(BE70)和中性缓冲福尔马林(NBF)固定之间的免疫组织化学染色。用小鼠脾脏中的抗Ki-67(A和B)、小鼠肾脏中的抗水通道蛋白1(AQP1)、小鼠大脑中的抗CD31(E和F)、兔免疫球蛋白G(IgG)等型对照(G)和无一级抗体对照(H)进行免疫组化染色。比例尺,50µm。
图4。
图4。
70%缓冲乙醇(BE70)固色剂的蛋白质数量和质量。(A) 使用双茚二酸(BCA)蛋白质检测试剂盒测量每种条件下提取的蛋白质量。蛋白质提取率表示为三个重复样品的平均值(平均值±SD)。(B) 用蛋白质印迹法评估不同固定液的蛋白质完整性。用4%~12%还原十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离不同固定液中提取的蛋白质,电印迹到硝化纤维素膜上,并用抗水通道蛋白1(AQP1;1:1000)进行检测。(C) 抗甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体免疫印迹法。将每个实体的相对GAPDH信号归一化为中性缓冲福尔马林(NBF)。缩写:E,70%乙醇。
图5。
图5。
不同固定液固定组织的RNA数量和质量。(A) 用纳米滴分光光度计测量从每个样本中提取的RNA数量。RNA提取率表示为三次重复的平均值(平均值±标准偏差[SD])。(B) 代表性数据显示为电泳图。为了比较在每种条件下提取的RNA的质量,我们使用电泳图覆盖所有七种不同条件。(C) RNA完整性表示为石蜡包埋RNA度量(PERM)。缩写:E,70%乙醇;BE70,缓冲乙醇70%;NBF,中性缓冲福尔马林;FF,新鲜冷冻小鼠肾脏(阳性对照)。
图6。
图6。
来自实验小鼠肾组织的RNA样品的RNA完整性图谱。采用多重逆转录聚合酶反应(RT-PCR)评估小鼠肾组织的基因表达谱。使用多重聚合酶链反应(MPCR)试剂盒(Maxim Biotech)测量肿瘤坏死因子信号基因谱。使用DNA 1000芯片在安捷伦2100生物分析仪上进行1微升的PCR反应。代表性数据显示为凝胶状图像(a)和电泳图(B)。每个样品的固定条件都显示在每条车道上方的凝胶状图像上:1,E(70%乙醇);2、EP(70%乙醇+0.5×PBS);3、EGP(70%乙醇+1%甘油+0.5×PBS);4、EAP(70%乙醇+0.5%冰乙酸+0.5×PBS);5、BE70(缓冲乙醇70%);6,NBF(中性缓冲福尔马林);F、 新鲜冷冻小鼠肾脏;P、 阳性对照;N、 阴性对照(水)。为了比较PCR扩增子的质量,我们使用电泳图来覆盖BE70和NBF固定条件。每个符号代表BE70和NBF之间的差异。(C) 测定了不同固定条件下肾组织中toll样受体-4(TLR-4)的平均周期阈值(Ct)。基因表达水平显示为方框图。这些值是平均定量实时RT-PCR循环阈值(Ct值)。(D) 在不同固定条件下测定肾组织中看家基因(18S rRNA)的平均C值。条形图表示标准偏差。新鲜冷冻(FF)小鼠肾脏用作阳性对照*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001.
图7。
图7。
来自固定在不同固定液中的组织的DNA数量和质量。(A) 用纳米滴分光光度计测量从每个样本中提取的RNA数量。DNA提取率表示为三次重复的平均值(平均值±SD)。(B) 使用BioScore™筛选和扩增试剂盒评估DNA质量。我们使用来自70%缓冲乙醇(BE70)的100-ng DNA模板扩增了约10µg DNA。(C) 看家基因次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的平均周期阈值(Ct)(高效放射治疗)在不同的固定条件下在肾脏中测定。基因表达水平如方框图所示。这些值是平均聚合酶链反应C值。条形图表示标准偏差。缩写:E,70%乙醇;NBF,中性缓冲福尔马林;FF,新鲜冷冻小鼠肾脏(阳性对照)*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001.

中的注释

  • 缓冲乙醇固定剂BE70的配方和pH值。
    休伊特SM。 休伊特SM。 组织化学与细胞化学杂志。2017年4月;65(4):251-252. doi:10.1369/0022155416687279。 组织化学与细胞化学杂志。2017 PMID:28347266 免费PMC文章。 没有可用的摘要。
  • 缓冲乙醇固定剂。
    日本基尔南。 日本基尔南。 组织化学与细胞化学杂志。2017年4月;65(4):251. doi:10.1369/0022155416687278。 组织化学与细胞化学杂志。2017 PMID:28347267 免费PMC文章。 没有可用的摘要。

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