Stable association of RNAi machinery is conserved between the cytoplasm and nucleus of human cells

doi:10.1261/rna.056499.116

.2016年7月；22(7):1085-98.

doi:10.1261/rna.056499.116。 Epub 2016年5月19日。

人类细胞的细胞质和细胞核之间保持RNAi机制的稳定关联

罗亚·卡兰塔里¹, 杰西卡·A·希克斯¹, 李连德¹, 基思·加格农², 维斯瓦纳达姆·斯里达拉^三, 安德鲁·莱莫夫^三, 哈米德·米尔扎伊^三, 大卫·R·科里¹

附属公司

¹美国德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心生物化学系药理学系，邮编75390。
²美国伊利诺伊州卡本代尔市南伊利诺伊大学生物化学与分子生物学系，邮编：62901。
^三美国德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心生物化学系，邮编75390。

PMID： 27198507
预防性维修识别码： PMC4911916型
内政部： 10.1261/rna.056499.116

人类细胞的细胞质和细胞核之间保持RNAi机制的稳定关联

罗亚·卡兰塔里等人。核糖核酸. 2016年7月.

.2016年7月；22(7):1085-98.

doi:10.1261/rna.056499.116。 Epub 2016年5月19日。

作者

罗亚·卡兰塔里¹, 杰西卡·A·希克斯¹, 李连德¹, 基思·加格农², 维斯瓦纳达姆·斯里达拉^三, 安德鲁·莱莫夫^三, 哈米德·米尔扎伊^三, 大卫·R·科里¹

附属公司

¹美国德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心生物化学系药理学系，邮编75390。
²美国伊利诺伊州卡本代尔市南伊利诺伊大学生物化学与分子生物学系，邮编：62901。
^三美国德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心生物化学系，邮编75390。

PMID： 27198507
预防性维修识别码： PMC4911916型
内政部： 10.1261/rna.056499.116

摘要

精氨酸2（AGO2）是RNAi的催化引擎，通常与细胞质翻译抑制有关。AGO2也参与包括转录和剪接在内的核过程。对于AGO2的核相互作用，以及它们与细胞质的差异，目前还很少有人了解。在这里，我们使用半定量质谱研究细胞质和细胞核AGO2的相互作用。质谱通常会显示出长长的候选蛋白质列表，这使得严格区分真正的相互作用伙伴和人工制品的工作变得复杂。我们使用正交分析策略对与标记的AGO2和内源性AGO2相关的蛋白质的复制质谱进行比较，从而确定候选物的优先级。与TRNC6A、TRNC6B、TNRC6C和AGO3的相互作用在细胞核和细胞质之间是保守的。TAR结合蛋白与细胞质AGO2而非细胞核AGO2稳定相互作用，与细胞质中的链负载一致。我们的数据表明，RNAi机制的重要功能成分之间的相互作用在细胞核和细胞质之间是保守的，但辅助蛋白不同。质谱的正交分析是简化蛋白质伙伴鉴定的有力方法。

关键词：Argonaute2；RNAi；质谱；细胞核；蛋白质组学。

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数字

**图1。**
质谱样品的特征。(A类)实验比较示意图。(B类)Western blot将Flag-AGO2水平与细胞质中的内源性AGO2水平以及细胞核中的表达进行比较。用SDS-PAGE分离细胞质和细胞核提取物，并用抗AGO2抗体进行印迹。Flag=来自标记AGO2稳定线的AGO2。与内源性相比，数值是过度表达的倍数。（Endog）来自T47D细胞的内源性AGO2。(C类)Western blot比较标记AGO2和内源性AGO2在细胞质中的表达(左边)并且在原子核中(*正确的*). 数值是细胞质和细胞核之间的分布水平。（Cyto）细胞质；（Nuc）细胞核。(D类)Flag-AGO2的荧光图像。绿色为Flag-AGO2，蓝色为细胞核（用DAPI，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚染色）。(E类)核糖核酸酶处理和非核糖核酶处理的核、细胞质和内质网蛋白标记物提取物的细胞质和核组分的Western blot分析。质谱前细胞质裂解物中Flag免疫沉淀的考马斯染色。对照组使用T47D细胞质裂解液，样品使用Flag-AGO2稳定系细胞质裂解物。～100 kDa的带被确定为AGO2。

**图2。**
鉴定未经核糖核酸酶处理的细胞质免疫沉淀（IP）候选物。(A类)从细胞质中的Flag-AGO2 IP识别出的候选的归一化光谱计数。n个= 3. (B类)从细胞质中的Flag-AGO2 IP识别出的候选气泡图。候选人按职能组织。(C类)从细胞质中的Flag-AGO2 IP识别出的候选样本和对照样本之间的归一化光谱计数的平均比率。当未给出比率时（仅在样本中确定候选人），分配的比率为100。大于100的比率在截止点处表示。(D类)从细胞质中内源性AGO2 IPs鉴定的候选物的归一化光谱计数。n个= 3. (E类)从细胞质中的内源性AGO2 IP识别出的候选气泡图。(F类)从细胞质中内源性AGO2 IPs鉴定的候选物的样本和对照之间归一化光谱计数的平均比率。当未给出比率时（仅在样本中确定候选人），分配的比率为100。大于100的比率在截止点处表示。

**图3。**
鉴定经核糖核酸酶处理的细胞质免疫沉淀（IP）候选物。(A类)从细胞质中的Flag-AGO2 IP中识别出的前20个候选物的归一化光谱计数。n个= 3. (B类)从细胞质中的Flag-AGO2 IP识别出的候选气泡图。候选人按职能组织。(C类)从细胞质中的Flag-AGO2 IP中识别出的前20个候选物（按比率）的样本和对照之间的归一化光谱计数的平均比率。当未给出比率时（仅在样本中确定候选人），分配的比率为100。图形的最大截止值为100。大于100的比率在截止点处表示。(D类)从细胞质内生AGO2 IP中识别出的前20个候选物的归一化光谱计数。n个= 3. (E类)从细胞质中的内源性AGO2 IP识别出的候选气泡图。(F类)从细胞质中内源性AGO2 IPs鉴定的候选物的样本和对照之间归一化光谱计数的平均比率。当未给出比率时（仅在样本中确定候选人），分配的比率为100。大于100的比率在截止点处表示。

**图4。**
鉴定未经核糖核酸酶治疗的核免疫沉淀（IP）候选物。(A类)从细胞核中的Flag-AGO2 IP识别出的候选者的归一化光谱计数。n个= 2. (B类)从核心中的Flag-AGO2 IP识别出的候选人的气泡图。候选人按职能组织。(C类)从细胞核中的Flag-AGO2 IP识别出的候选样品和对照样品之间的归一化光谱计数的平均比率。当未给出比率时（仅在样本中确定候选人），分配的比率为100。图形的最大截止值为100。大于100的比率在截止点处表示。(D类)从细胞核内的内源性AGO2 IP中识别出的候选者的归一化光谱计数。n个= 3. (E类)从细胞核内内源性AGO2 IP识别出的候选气泡图。(F类)样本和对照之间归一化光谱计数的平均比率，用于从细胞核内的内源性AGO2 IP中识别候选物。当未给出比率时（仅在样本中确定候选人），分配的比率为100。大于100的比率在截止点处表示。

**图5。**
鉴定经核糖核酸酶治疗的核免疫沉淀（IP）候选物。(A类)从细胞核中的Flag-AGO2 IP识别出的候选者的归一化光谱计数。n个= 2. (B类)从核心中的Flag-AGO2 IP识别出的候选人的气泡图。候选人按职能组织。(C类)从细胞核中的Flag-AGO2 IP识别出的候选样品和对照样品之间的归一化光谱计数的平均比率。当未给出比率时（仅在样本中确定候选人），分配的比率为100。图形的最大截止值为100。大于100的比率在截止点处表示。(D类)从细胞核内的内源性AGO2 IP中识别出的候选者的归一化光谱计数。n个= 3. (E类)从细胞核内内源性AGO2 IP识别出的候选气泡图。候选人按职能组织。(F类)样本和对照之间归一化光谱计数的平均比率，用于从细胞核内的内源性AGO2 IP中识别候选物。当未给出比率时（仅在样本中确定候选人），分配的比率为100。大于100的比率在截止点处表示。

**图6。**
候选相互作用因子的协同免疫沉淀。(A类)AGO2的Co-IP与来自细胞核的RNAi因子。与IgG对照组相比，对AGO2进行免疫沉淀，并通过Western blot对相互作用因子与抗体进行印迹。(B类)质谱鉴定的Aga-AGO2与来自细胞核的相互作用因子的Co-IP。与内源性T47D细胞的Flag IP相比，Flag-AGO2从Flag-AGO2稳定系细胞免疫沉淀。免疫印迹法检测抗体与相互作用因子。(C类)AGO2的Co-IP与来自细胞核的潜在相互作用因子。与IgG对照组相比，对AGO2进行免疫沉淀，并通过Western blot对相互作用因子与抗体进行印迹。(D类)核AGO2活性模型。AGO2与细胞质中的TRNC6蛋白和AGO3结合。AGO2由DICER、TRBP和其他加载因子加载。然后，主动RISC被穿梭到原子核中。与DICER和TRBP的相互作用在核内更为短暂。然后，根据AGO2结合的小RNA，负载的AGO2和TNRC6蛋白可以改变细胞核内的转录或剪接。

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[1] Ameyar-Zazoua M、Rachez C、Souidi M、Robin P、Fritsch L、Young R、Morozova N、Fenouil R、Descostes N、Andrau JC等，2012年。精氨酸蛋白将染色质沉默与选择性剪接结合。《自然结构分子生物学》19:998–1004。-公共医学

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[8] Carissimi C、Laudadio I、Cipolletta E、Giiosa S、Mihailovich M、Bonaldi T、Macino G、Fulci V，2015年。ARGONAUTE2与SWI/SNF复合物合作，以确定人类转录起始位点的核小体占有率。核酸研究43:1498–1512。-项目管理委员会-公共医学

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