NOTCH Signaling Regulates Asymmetric Cell Fate of Fast- and Slow-Cycling Colon Cancer-Initiating Cells

doi:10.1158/0008-5472.CAN-15-3198

.2016年6月1日；76(11):3411-21.

doi:10.1158/0008-5472.CAN-15-3198。 Epub 2016年4月11日。

NOTCH信号调节快周期和慢周期结肠癌起始细胞的不对称细胞命运

附属公司

¹纽约伊萨卡康奈尔大学生物医学工程系。
²纽约州纽约威尔康奈尔医学院医学系、遗传医学外科和病理学系。
^三纽约州伊萨卡市康奈尔大学生物医学工程系。
⁴纽约伊萨卡康奈尔大学生物与环境工程系。
⁵康奈尔大学电气与计算机工程学院，纽约伊萨卡。
⁶纽约布朗克斯阿尔伯特·爱因斯坦医学院医学与细胞生物学。
⁷纽约州纽约威尔康奈尔医学院医学系、遗传医学外科和病理学系。xs37@duke.edu stl2012@med.cornell.edu。
⁸纽约州伊萨卡市康奈尔大学生物医学工程系。纽约州伊萨卡市康乃尔大学电气与计算机工程学院。北卡罗来纳州达勒姆市杜克大学生物医学工程学系。xs37@duke.edu stl2012@med.cornell.edu。

PMID： 27197180
预防性维修识别码： PMC4891252
内政部： 10.1158/0008-5472.CAN-15-3198

NOTCH信号调节快周期和慢周期结肠癌起始细胞的不对称细胞命运

塔拉·斯里尼瓦桑等。癌症研究. 2016.

.2016年6月1日；76(11):3411-21.

doi:10.1158/0008-5472.CAN-15-3198。 Epub 2016年4月11日。

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¹纽约伊萨卡康奈尔大学生物医学工程系。
²纽约州纽约威尔康奈尔医学院医学系、遗传医学外科和病理学系。
^三纽约州伊萨卡市康奈尔大学生物医学工程系。
⁴纽约伊萨卡康奈尔大学生物与环境工程系。
⁵康奈尔大学电气与计算机工程学院，纽约伊萨卡。
⁶纽约布朗克斯阿尔伯特·爱因斯坦医学院医学与细胞生物学。
⁷纽约州纽约威尔康奈尔医学院医学系、遗传医学外科和病理学系。xs37@duke.edu stl2012@med.cornell.edu。
⁸纽约州伊萨卡市康奈尔大学生物医学工程系。纽约州伊萨卡市康乃尔大学电气与计算机工程学院。北卡罗来纳州达勒姆市杜克大学生物医学工程学系。xs37@duke.edu stl2012@med.cornell.edu。

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摘要

具有干细胞特性的结肠癌细胞，称为结肠癌诱导细胞（CCIC），具有很高的致瘤潜力。虽然CCIC可以分化以促进细胞异质性，但尚不清楚肿瘤内的CCIC是否包含不同的亚群。在这里，我们描述了快循环和慢循环CCIC的共存，它们可以通过不对称分裂相互生成，突出了CCIC的可塑性和互换性。快速循环CCIC表达标记，如LGR5和CD133，依赖MYC进行增殖，而慢速循环CCIC表示标记，如BMI1和hTERT，独立于MYC。NOTCH信号促进不对称细胞命运，调节这两个群体之间的平衡。总的来说，我们的结果通过定义慢循环和快循环CCIC之间的直接相互转化机制，阐明了CCIC异质性和塑性的基础。癌症研究；76(11); 3411-21. ©2016 AACR版权所有。

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数字

**图1。原发性CRC肿瘤包含BMI1+/LGR5+细胞对**
(一)人类结直肠癌（CRC）第一阶段（顶行）和第四阶段（底行）的低（左）和高（右）放大率H&E图像。比例尺：50μm（左），25μm（右）。(b条)CRC阶段IV的代表性co-IF显示BMI1+（红色）/LGR5（绿色）不对称CCIC对。DAPI（蓝色）标记细胞核；比例尺：25μm。**（c）**在CRC肿瘤组织中，BMI1+或LGR5+细胞作为单细胞、对称分裂（α-TUBULIN+）对或BMI1+/LGR5+不对称分裂细胞对相关的百分比。数据表示n个=500个细胞/样本中的20个肿瘤（**，p=0.01；学生t检验）。(d日)左：CRC样本的代表性co-IF，显示LGR5（绿色）、BMI1（红色）和α-管蛋白（紫色）表达。图中还显示了NUMB（绿色）和PARD3A（红色）表达式。Ki67染色（绿色）；DAPI（蓝色）；比例尺：25μm。中间：基于co-IF的正常结肠与CRC肿瘤组织中（α-TUBULIN+）BMI1+/LGR5+不对称细胞对的分裂频率。数据表示平均±SDn个=来自500对TUBULIN+样本的20个正常或CRC样本（***，p=0.001；学生t检验）。右：不对称BMI1+/LGR5+对中表达NUMB或PARD3A的BMI1+或LGR5+细胞的百分比。数据表示来自n个=20个肿瘤（**，p=0.01；学生t检验）。

**图2。不对称BMI1+/LGR5+CCIC-1子对**
**（a）**左：单个NOTCH1−/LGR5+CCIC（顶面板）和NOTCH1+/LGR5−CCIC（底面板）的时间序列，在48小时内经历不对称分割。48小时固定后的Co-IF：LGR5（绿色）、BMI1（红色）、DAPI（蓝色）；比例尺：10μm。右：排序NOTCH1/LGR5 CCIC中不对称BMI1+/LGR5+（蓝色）、对称BMI1+/BMI1+（灰色）或对称LGR5+/LGR5+（白色）单元对的频率。数据表示3个独立实验的平均值±SDn个=100 LGR5+细胞/复制或n个=1000 NOTCH1+（BMI1+）细胞/复制（**，p=0.01；学生t检验）。**（b）**用BMI1-mCherry启动子报告子构建慢病毒转导CCIC。左：FACS图（左）以及由FACS确定的BMI1+和LGR5+CCIC的百分比（右）。数据表示3个独立实验的平均值±SD。（**，p=0.01；学生t检验）。**（c）**左图：单个BMI1+CCIC（顶面板）和LGR5+CCIC的时间序列在24小时内经历不对称分割。BF:BMI1-m樱桃（红色）。24小时Co-IF抗体染色：BMI1（红色）；LGR5（绿色）；DAPI（蓝色）；比例尺：10μm。右：排序的BMI1+或LGR5+CCIC中非对称BMI1+/LGR5+（蓝色）或对称（黑色）单元对的频率。数据表示3个独立实验的平均值±SDn个=100 LGR5+细胞/复制或*n个=*1000个BMI1+细胞/重复（**，p=0.01；学生t检验）。**（d）**定量分析不对称BMI1+/LGR5+CCIC对中表达NUMB或PARD3A的BMI1+或LGR5+子代的百分比。数据代表3个独立实验的平均值±SDn个=500对/重复（**，p=0.01；学生t检验）。**（e）**在CCIC分立后成立BrdU。左：LGR5（绿色）、BMI1（红色）和BrdU（紫色）染色。DAPI（蓝色）；比例尺：10μm。右：定量分析不对称BMI1+/LGR5+对，显示LGR5+CCIC、BMI1+CCIC或LGR5~+和BMI1+CCIC子体中BrdU掺入百分比（**，p=0.004，单向方差分析）。数据表示3个独立实验的平均值±SDn个=500个细胞对/复制。

**图3。BMI1+/LGR5+CCIC-1子对中的MYC敲除**
**（a）**单个CCIC用打乱的shRNA（Sc.shRNA）或MYC-shRNA慢病毒转导。左：CCIC子对经历BMI1+/LGR5+不对称、LGR5+symmetric或BMI1+对称分裂。LGR5（绿色）、BMI1（红色）、α-TUBULIN（紫色）、DAPI（蓝色）、比例尺：10μm。右：由LGR5、BMI1和α-TUBULIN表达的co-IF确定的BMI1+/LGR5+不对称（蓝色）、BMI1+/BMI1+对称（灰色）或LGR5+/LGR5+对称（白色）CCIC对的百分比。数据表示三个独立实验的平均值±SDn个=500微管蛋白+对/重复（**，p=0.0033，单向方差分析）。**（b）**在用MYC-shRNA转导的单个CCIC分裂后合并BrdU。左：co-IF:LGR5（绿色）、BMI1（红色）、BrdU（紫色）、DAPI（蓝色）；比例尺：10μm。右图：定量分析不对称BMI1+/LGR5+对中BrdU在LGR5+CCIC、BMI1+CCIC，LGR5+/BMI1+CCIC中的掺入百分比，或两者均未显示（**，p=0.005，单向方差分析）。数据表示3个独立实验的平均值±SDn个=500个细胞/复制。**（c）**用打乱shRNA（左）或MYC-shRNA（右）转导的CCIC的FACS分析显示，LGR5和BMI1在门控Ki67+人群中表达。

**图4。NOTCH抑制减少BMI1+/LGR5+CCIC-1子对**
**（a）**二甲基亚砜与DAPT处理CCIC的对细胞分析。左图：NOTCH1（紫色）在BMI1+（红色）/LGR5+（绿色）对中的表达。DAPI标记细胞核；比例尺：10μm。中间：Hes1和Hes5表达的RT-qPCR测量。右：每个治疗条件下的BMI1+/LGR5+不对称（蓝色）、BMI1+/BMI1+对称（灰色）和LGR5+/LGR5+对称（白色）细胞对的分数（**，p=0.01；单向方差分析）。(b条)左：感染干扰shRNA（对照）或JAG-1 shRNA的CCIC子对的JAG-1（红色）染色。比例尺：10μm。中间：JAG-1击倒降低Hes1和Hes5。右：JAG-1 shRNA降低了CCIC中不对称BMI1+/LGR5+对（蓝色）的频率（**，p=0.0028；学生t检验）。(**c（c）**)左：空载体（EV）或NUMB-SYM转导的CCIC中的NUMB（绿色）染色。比例尺：10μm。中间：RT-qPCR检测Hes1和Hes5的表达。右图：表达CCIC的NUMB-SYM中不对称BMI1+/LGR5+细胞对的分数（蓝色）降低（**，p=0.0022；学生t检验）。在所有面板中，进行了三次RT-PCR，并以平均值±SD表示；细胞对分析的数据表示三个独立实验的平均值±SDn个=500管+对/复制。

**图5。NOTCH信号传导促进BMI1+/LGR5+CIC-1子对**
(一)左：感染扰乱shRNA（对照）或NUMB-shRNA的CCIC子对的NUMB（绿色）染色。比例尺：10μm。中间：NUMB击倒增加Hes1和Hes5的表达。右：NUMB击倒后不对称BMI1+/LGR5+对（蓝色）的频率增加（**，p=0.008；学生t-test）。(b条)CCIC感染了异位NICD表达（NICD-OE）结构。左：NICD-OE BMI1+（红色）/LGR5+（绿色）CCIC对的Co-IF，表示差异不对称NOTCH1（紫色）表达。中间：通过RT-qPCR测定Hes1和Hes5水平。右：NICD-OE增加了不对称BMI1+/LGR5+对（蓝色）的频率（**，p=0.0019；学生t检验）。在所有面板中，进行了三次RT-PCR，并以平均值±SD表示；细胞对分析的数据表示三个独立实验的平均值±SDn个=500管+对/复制。

**图6。来自CCIC-1系的异种移植瘤**
**（a）**表达BMI1-mcherry启动子报告子的CCIC-1细胞用打乱的shRNA（Sc.shRNA）或MYC-shRNA慢病毒转导。1×10⁶将未分类、BMI1+或LGR5+分类的CCIC皮下注射到NOD/SCID小鼠中(*n个=*5）发展肿瘤4周。显示肿瘤发病率（左）、肿瘤体积（中）和肿瘤中BMI1+或LGR5+CCIC的百分比（右）。数据表示平均值±标准偏差。（***，p=0.0004；**，p=0.01；*，p:0.02；单向方差分析）。**（b）**1×10⁶将未分类的CCICs皮下注射到NOD/SCID小鼠中(n个=6）发生肿瘤4周；然后在72小时内用二甲基亚砜或DAPT注射肿瘤。左：肿瘤co-IF:BMI1+（红色）、LGR5+（绿色）、α-管蛋白（紫色）、Ki67（绿色）和DAPI（蓝色）；比例尺：25μm。右：异种移植瘤中BMI1+/LGR5+不对称（蓝色）、BMI1+/BMI1+对称（灰色）或LGR5+/LGR5+对称（白色）细胞对的频率由LGR5、BMI1和α-TUBULIN的co-IF确定。数据代表的平均值±SDn个=500微管+分隔对/鼠标（**，p=0.003，学生t-test）。**（c）**代表性FACS图（左）和由FACS（右）从（f）中描述的肿瘤中确定的BMI1+/LGR5+细胞的比率。数据代表的是n个=3只小鼠/条件。（***，p=0.0002；学生t检验）。

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