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.2016年5月16日6:26013。
doi:10.1038/srep26013。

人类小脑多蛋白的被动清晰度和免疫荧光标记研究进展：了解线粒体疾病中神经退行性变的机制

乔纳森·菲利普斯 1, 亚历克斯·劳德 2, 罗伯特·莱特沃尔斯 1 3, 克里斯·莫里斯 4, 道格·M·特恩布尔 1, Nichola Z Lax公司 1
附属公司

人类小脑多蛋白的被动清晰度和免疫荧光标记研究进展：了解线粒体疾病中神经退行性变的机制

乔纳森·菲利普斯等。 科学代表. .

摘要

CLARITY能够对大量组织进行免疫荧光标记和成像，以便更好地了解细胞形态和不同细胞类型之间的空间相互作用之间的三维关系。在当前的研究中，我们优化了小鼠和人类脑组织中神经元和线粒体蛋白的被动清晰度和免疫荧光标记，以进一步了解线粒体疾病中发生的神经变性机制。这是第一项利用多聚甲醛固定的人小脑和冷冻保护的福尔马林固定组织的研究，为存档组织的使用开辟了进一步的途径。我们优化了小鼠（n=5）和人类（n=9）小脑的水凝胶包埋和脂质的被动清除，并开发了一种免疫荧光方案，该方案始终标记不同的神经元域和血管。除了可视化大结构外，我们还能够可视化被动清除组织中的线粒体蛋白，以揭示与线粒体疾病相关的呼吸链缺陷。我们还通过剥离抗体和重新保护小脑来证明组织的多种用途。这项技术允许询问大量完整的大脑样本，以便更好地了解线粒体疾病中发生的复杂病理变化。

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图1
图1。在野生型小鼠脑切片上演示被动清晰度和优化免疫荧光标记条件。
12个月大的野生型C57/Bl6小鼠小脑切片的代表性图像显示了被动清除前后的不同厚度(一). 被动清除的小脑切片用针对孔蛋白（绿色）、神经丝H（NF-H；红色）和髓鞘碱性蛋白（MBP；紫色）的抗体进行免疫荧光标记。对免疫标记方案的各种条件进行了测试；(b条)硼酸钠缓冲液37 24°C 小时(c（c）)硼酸钠缓冲液4 初级抗体的温度为6天，然后为4天 对于次级抗体，持续4天(d日)PBST为4 初级抗体的温度为6天，然后为4天 第二抗体在°C下持续4天，以及（e）被动清除组织切片的优势体现在未清除的切片中，该切片使用(d日). 比例：100 微米。
图2
图2。被动清除250μm小鼠小脑中神经元、轴突和线粒体蛋白的免疫荧光标记的代表性图像。
被动清除250 μm野生型小鼠小脑切片染色，检测小脑中常见的神经元和线粒体蛋白。钙结合蛋白((一); 红色；546 nm）和小白蛋白((b条); 紫色；647 nm）抗体阳性标记Purkinje细胞体。通过阳性神经丝标记观察浦肯野细胞轴突((c（c）); 红色；546 纳米；NF-H，以及(d日); 红色；546 纳米；SMI-31）和髓磷脂((e（电子）); 紫色；647 纳米；MBP）。通过COXI蛋白阳性标记检测线粒体((（f）); 紫色；647 纳米；COXI）。比例尺：100 微米。
图3
图3。演示不同神经元亚室、血管和线粒体的被动清晰度和免疫荧光标记。
250 37岁时，对来自对照个体和线粒体疾病患者的μm人小脑切片进行了被动清除 °C持续4周(一). 免疫荧光染色的质量取决于被动清除的持续时间；2周的被动清除使颗粒细胞层（NF-H；绿色；488 nm和MBP；红色，546 nm），线粒体无标记（COXI；紫色；647 纳米；(b条)). 将被动清除延长至4周后，可识别Purkinje细胞及其轴突（NF-H，绿色；488 nm）及其髓鞘（MBP；红色，546 nm）和线粒体（COXI；紫色；647 纳米；(b条)). 小脑被动清除四周后，线粒体（COXI；紫色；647 nm）和有髓浦肯野细胞轴突（NF-H；绿色；488 nm和MBP；红色；546 nm）是线粒体疾病对照组和患者死后的人类小脑组织(c（c）). 使用抗体组合，可以标记神经元并追踪其三维投射，包括浦肯野细胞（NF-H）、轴突（NF-H和MBP）及其树突树突（NF-H(d日)). 还可以检测血管网络（谷氨酸-1和α-平滑肌肌动蛋白(d日)). 比例：100 微米。
图4
图4。人类小脑浦肯野细胞神经元线粒体呼吸链缺陷的评估。
250 被动清除μm厚的小脑切片并进行免疫荧光标记，以确定线粒体质量（孔蛋白和SDHA，647 nm）和线粒体呼吸链内的复合物I亚基（NDUFB8和NDUFA13；546 nm）与神经元标记物（NF-H；488 nm）在控制1中(一). 探讨Purkinje细胞中呼吸链缺陷（相对于线粒体质量而言复合物I亚单位丰度减少）及其在线粒体疾病神经元患者（NF-H；488 纳米），线粒体（孔蛋白；647 nm）和复合物I亚基（NDUFB8；546 nm）免疫荧光标记。对照Purkinje细胞显示NDUFB8蛋白相对于孔蛋白的匹配丰度（对照1和2），而患者Purkinje细胞和周围神经元显示NDUVB8蛋白相对于孔蛋白水平的缺失，证实这些细胞中存在复杂I缺陷线粒体（患者2和4(b条)). 比例：100 微米。
图5
图5。四重免疫荧光后人类小脑浦肯野细胞及其有髓轴突的代表性图像。
被动清除250 对人小脑切片进行μm厚的神经丝H（蓝色）、NDUFA13（红色）、COX4（绿色）和髓鞘碱性蛋白（紫色）染色。通过NDUFA13（红色）和COX4（绿色）的阳性标记，线粒体清晰可见。Purkinje细胞轴突的髓鞘（髓鞘碱性蛋白，647）已被清楚标记。在405中 nm通道中存在高水平的自体荧光，难以观察浦肯野细胞轴突（神经丝H）。405中存在自体荧光 nm和488 通过非一级抗体对照组证实了nm通道。比例：100 微米。
图6
图6。重复使用被动清理和染色250 μm厚的对照小脑切片。
被动清除的切片最初染色为α-平滑肌肌动蛋白（紫色；647 nm），神经丝H（绿色；488 nm）和谷氨酸-1（红色；546 nm）生成小脑血管网络的清晰图像(一). 在清洁溶液中孵育一周后，去除抗体，然后用COX1（紫色；647 nm），神经丝H（绿色；488 nm）和髓鞘碱性蛋白（红色；546 nm）显示线粒体在有髓轴突中的分布(b条). 比例：100 微米。
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