Inhibition of EHMT2/G9a epigenetically increases the transcription of Beclin-1 via an increase in ROS and activation of NF-κB

doi:10.18632/oncotarget.9290

.2016年6月28日；7(26):39796-39808.

doi:10.18632/目标9290。

抑制EHMT2/G9a通过增加ROS和激活NF-κB表观遗传学增加Beclin-1的转录

附属机构

¹韩国首尔Asan医学中心创新癌症研究所。
²韩国首尔医学院蔚山大学泌尿系。
^三韩国旭化成大学医学院医学工程系。
⁴韩国首尔阿桑医学中心阿桑生命科学研究所。
⁵韩国首尔医学院蔚山大学会聚医学系。
⁶韩国首尔Asan医疗中心神经科。
⁷韩国首尔Asan医疗中心泌尿科。
⁸韩国首尔医学院蔚山大学神经损伤研究实验室。
⁹韩国永宁庆熙大学东西医学研究生院。

采购管理信息： 27174920
PMCID公司：项目经理5129971
内政部： 10.18632/目标9290

抑制EHMT2/G9a通过增加ROS和激活NF-κB表观遗传学增加Beclin-1的转录

桑恩公园等。 Oncotarget公司. 2016.

.2016年6月28日；7(26):39796-39808.

doi:10.18632/目标9290。

作者

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¹韩国首尔Asan医学中心创新癌症研究所。
²韩国首尔医学院蔚山大学泌尿系。
^三韩国旭化成大学医学院医学工程系。
⁴韩国首尔阿桑医学中心阿桑生命科学研究所。
⁵韩国首尔医学院蔚山大学会聚医学系。
⁶韩国首尔Asan医疗中心神经科。
⁷韩国首尔Asan医疗中心泌尿科。
⁸韩国首尔医学院蔚山大学神经损伤研究实验室。
⁹韩国永宁庆熙大学东西医学研究生院。

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摘要

我们之前报道过BIX-01294（BIX），一种常染色组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶2（EHMT2/G9a）的小分子抑制剂，在MCF-7细胞中诱导活性氧（ROS）依赖性自噬。在此，我们分析了调节肿瘤抑制因子和自噬相关基因（ATG）Beclin-1转录的表观遗传学机制。抑制EHMT2可减少组蛋白H3（H3K9me2）上赖氨酸9的二甲基化，并从Beclin-1启动子中分离出EHMT2和H3K9 me2。对该启动子，RNA聚合酶II和核因子κB（NF-κB）以活性氧依赖的方式被招募，导致转录激活。此外，用BIX处理通过EHMT2和DNA甲基转移酶1（DNMT1）的协同作用逆转了Beclin-1的抑制。因此，与BIX和DNMT1抑制剂5-Aza-2'-脱氧胞苷（5-Aza-Cd）联合治疗对Beclin-1表达产生协同作用。重要的是，EHMT2的高表达水平与Beclin-1的低表达水平显著相关，这与预后不良有关。这些发现表明，EHMT2可以直接抑制Beclin-1，并且抑制EHMT2可能是通过激活自噬预防癌症的有用治疗方法。

关键词：贝克林-1；EHMT2/G9a；自噬；表观遗传调控；组蛋白甲基转移酶。

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利益冲突声明

作者声明没有与本研究相关的竞争利益。

数字

**图1。抑制EHMT2增加Beclin-1的表达**
a。用10μM BIX处理GFP-MCF-7细胞2 h。用荧光显微镜检查细胞。比例尺，50μm。b。两种乳腺癌细胞系（MCF-7，*贝克林-1^+/−*; HS578T，*贝克林-1^+/+*)用10μM BIX处理指定的时间。Beclin-1转录物和蛋白表达分别通过RT-PCR（下面板）和Western blotting（上面板）测定。c。RT2 Profiler PCR分析ATG表达。该图包括一个“热图”，这是图中包含颜色（红、绿和黑）的部分，其中颜色代表基因的表达水平；红色和绿色分别代表高表达和低表达。表达水平连续映射在图顶部提供的色标上。热图表示不使用或使用10μM BIX处理4或24小时的MCF-7细胞中的差异基因表达模式。d。图表显示了用BIX处理24小时的细胞与未处理细胞中mRNA转录水平的折叠变化。每个圆圈代表一个自噬基因；折叠变化最大的用红色表示。中心线表示表达无变化；中线以上表示基因表达增加；线下是那些水平降低的基因。灰色线条表示增加或减少2倍。**e、。**用siCont或EHMT2 siRNA（siEHMT2）转染MCF-7细胞48小时。使用所示抗体进行蛋白质印迹分析。**f、。**用2μg pcDNA3空载体（MOCK）或1或2μg pcDNA3-Flag-EHMT2（Flag-EHMT2）转染MCF-7细胞24h；pcDNA3空载体作为阴性对照。使用所示抗体进行蛋白质印迹分析。

**图2。表观遗传学转录激活*贝克林-1*通过EHMT2抑制**
a。一对乳腺癌细胞系（MCF-7：*贝克林-1^+/负极*和HS578T：*贝克林-1^+/+*)用10μM BIX、10μg/ml CHX、1μg/ml ACD或这些化合物的组合处理4 h。Beclin-1转录物和蛋白质表达分别通过RT-PCR（上面板）和Western blotting（下面板）测定。b。用10μM BIX和/或1μg/ml ACD处理MCF-7细胞4 h。在光学显微镜下检查细胞形态。比例尺：50μm。**c、 d日**和**e、。**用10μM BIX处理MCF-7细胞和HS578T细胞4h，或用1μM siEHMT2转染MCF-7。用ChIP分析处理后的细胞。用抗H3K9me2、抗EHMT2和抗RNA pol II抗体进行的ChIP分析与作为阴性对照的正常兔IgG进行了比较。应用等量（输入）的DNA-蛋白质复合物。实时量化*贝克林-1*启动子序列是用抗H3K9me2 ChIP、抗EHMT2 ChIP和抗RNA pol II ChIP（右面板）进行的。结果是相对于输入的结果，是以三个独立实验的平均值±SEM表示的对照的折叠变化*通过单因素方差分析，与对照组或siCont相比，P<0.001。

**图3。的转录*贝克林-1*由NF-κB驱动**
a。ChIP分析揭示内源性NF-κB与*贝克林-1*启动子。使用非特异性兔IgG作为抗体对照。用10μM BIX处理MCF-7和HS578T细胞4h，然后进行分析。应用等量（输入）的DNA-蛋白质复合物。实时量化*贝克林-1*使用抗NF-κB/p65 ChIP在MCF-7和HS578T细胞中执行启动子序列（右面板）。数据是相对于输入的，是相对于三个独立实验的平均值±SEM表示的控制值的折叠变化*与单向方差分析对照组相比，P<0.001。b。使用Alexa488（绿色）结合抗体检测65kDa亚单位的NF-κB。用Hoechst 33258（蓝色）观察细胞核。在对照细胞中，NF-κB/p65免疫反应优先出现在细胞质中。添加10μM BIX后4 h，NF-κB/p65主要定位于细胞核。比例尺，50μm。右侧面板显示了NF-κB/p65易位的量化。显示了核NF-κB/p65的细胞百分比，误差条代表S.D.（四个实验，每个条件和实验至少分析50个细胞）。数据通过分析TS Auto进行分析（平均值±S.D.，n=3；成对t吨-与BIX相比，*P<0.001）。c。BIX的蛋白质印迹诱导NF-κB/p65的核转位。分别从各组中分离细胞核和细胞溶质部分，并分别用抗NF-κB/p65、抗GAPDH（细胞质标记物）和抗拉明B（核标记物）抗体进行印迹。d。使用暴露于10μM BIX的MCF-7细胞裂解液对指定抗体（与NF-κB上游区域相关）进行蛋白质印迹。**e、。**NF-κB抑制剂CAPE对Beclin-1表达的影响。将MCF-7细胞与10 mM CAPE结合或不结合10μM BIX孵育4 h。用抗Beclin-1抗体进行蛋白质印迹。

**图4。细胞内ROS介导的自噬激活对EHMT2抑制的反应**
a。活性氧清除剂NAC抑制NF-κB核转位。在4 mM NAC存在下，用10μM BIX处理MCF-7细胞4 h。然后用荧光显微镜检查细胞。使用Alexa488（绿色）结合抗体检测65 kDa亚单位的NF-κB。用Hoechst 33258（蓝色）观察细胞核。比例尺，50μm。下部面板显示了移位NF-κB/p65的定量。显示了核NF-κB/p65的细胞百分比，误差条代表S.D.（四个实验，每个条件和实验至少分析50个细胞）。数据表示为三个独立实验的平均值±SEM*通过单因素方差分析，与BIX相比P<0.05。b。NAC抑制ROS导致Beclin-1表达降低。在有或无4mM NAC的情况下，用10μM BIX处理MCF-7细胞4小时。使用指定的抗体进行蛋白质印迹。

**图5。DNMT1和EHMT2在抑制Beclin-1表达中的协同作用**
a。IP后的蛋白质印迹显示BIX处理降低了EHMT2和DNMT1之间的物理结合。b。用10μM 5-Aza-Cd、10μM BIX或两者联合处理MCF7细胞前后检测Beclin-1表达的代表性Western blots。c。甲基化特异性PCR（MSP）分析*贝克林-1*用10μM 5-Aza-Cd处理48小时、10μM BIX处理1小时或两种处理的组合处理MCF7细胞的启动子区域。

**图6。高EHMT2和低Beclin-1表达与乳腺癌患者预后不良的相关性**
a。Western blot法比较正常和肿瘤乳腺组织裂解物中EHMT2和Beclin-1的表达。b。乳腺癌患者肿瘤组织细胞裂解物中EHMT2和Beclin-1的蛋白印迹。**c、 d。**NKI的乳腺癌患者(n个=295，左侧面板）和UNC(n个=223，右图）队列根据Beclin-1和*EHMT2型*对Beclin-1和EHMT2表达水平较高或Beclin-1和EHMT 2表达水平较低的患者进行分析。**e、。**使用Pearson相关检验估计TCGA乳腺癌患者中Beclin-1和EHMT2表达之间的相关性。**f、。**Beclin-1再激活示意图。BIX处理降低了H3K9me2水平，导致染色质结构开放。NF-κB可以以ROS依赖的方式被募集到启动子，导致*贝克林-1*以及自噬的激活。

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