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.2016年8月2日；12(8):1215-28.
doi:10.1080/15548627.2016.1179401。 Epub 2016年5月12日。

通过PARK7降解通过伴侣介导的自噬对线粒体形态和功能的基本控制

王宝（Bao Wang） 1, 蔡志彪 1, 凯涛 1, 曾伟军（Weijun Zeng） 1, 芳芳路 1, 杨瑞欣 1, 大云峰 1, 高国栋 1, 钱扬 1
附属机构

伴侣介导的通过PARK7降解的自噬对线粒体形态和功能的基本控制

王宝（Bao Wang）等。 自噬. .

摘要

作为一种选择性降解系统，伴侣介导的自噬（CMA）对于维持细胞在应激条件下的内环境稳定和生存至关重要。越来越多的证据表明，CMA功能障碍在帕金森病（PD）发病机制中起着重要作用。然而，CMA在压力下调节神经元存活的机制及其在神经退行性疾病中的作用尚不完全清楚。PARK7/DJ-1是一个常染色体隐性遗传家族性PD基因。PARK7在抗氧化反应中起着关键作用，其功能障碍导致线粒体缺陷。在目前的研究中，我们发现CMA介导了PARK7的溶酶体依赖性降解。重要的是，CMA优先去除氧化损伤的非功能性PARK7蛋白。此外，CMA保护细胞免受线粒体毒素MPP（+）诱导的线粒体形态和功能变化的影响，并提高细胞活力。在缺乏PARK7的情况下，这些保护作用消失。相反，PARK7的过度表达显著减轻了线粒体功能障碍，并通过在氧化应激下阻断CMA而加剧了细胞死亡。因此，我们的研究结果揭示了CMA通过降解非功能性PARK7并维持其体内平衡来保护线粒体功能的机制，而该途径的失调可能会导致PD发病机制中的神经元应激和死亡。

关键词：CMA；DJ-1；PARK7；帕金森病；线粒体；神经元死亡。

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数字

图1。
图1。
溶酶体降解PARK7。（A） 抑制溶酶体活性对PARK7的影响。SN4741细胞与NH孵育4用免疫印迹法分析Cl和leupeptin（本实验和后续实验中使用的Leup；100μM）18小时后PARK7的水平。右图显示了PARK7水平的量化（平均值±SEM，n=3；**，P（P）与对照组相比<0.01）。（B） 血清剥夺对PARK7的影响。SN4741细胞保存在无血清培养基中，无NH或NH存在4Cl和亮氨酸肽（Leup）24小时。免疫印迹法分析PARK7水平。右图显示了PARK7水平的量化（平均值±SEM，n=3；**，P（P）与对照组相比<0.01；#，P（P）与无血清组相比<0.01）。（C） 血清剥夺对PARK7和LAMP1共定位的影响。SN4741细胞按（B）所述进行处理。通过免疫荧光测定PARK7和LAMP1的共定位。提供了放大图像。计算共定位率。比例尺：50μm。（D） 3-MA对PARK7的影响。用3-MA处理SN4741细胞8h，用免疫印迹法检测PARK7、MAP1LC3B-I/II和SQSTM1的水平。下图显示了PARK7水平的量化（平均值±SEM，n=3）。（E） 3-MA对血清抽出诱导的PARK7下降的影响。将SN4741细胞在含有或不含3-MA的无血清培养基中保存指定时间，并通过免疫印迹法检测PARK7的水平。下图显示了PARK7水平的量化（平均值±SEM，n=3；**，P（P）与对照组相比<0.01）。（F） MG-132对PARK7水平的影响。用蛋白酶体抑制剂MG132处理SN4741细胞8小时，并通过抗泛素（Ub）和抗PARK7印迹法测定PARK8的水平。右图显示了PARK7水平的量化（平均值±SEM，n=3）。
图2。
图2。
CMA对PARK7的降解。（A） PARK7和HSPA8之间的相互作用。左图：转染Flag-PARK7的HEK293细胞的裂解物用抗HSPA8抗体免疫沉淀。如图所示，用抗Flag抗体对沉淀物进行Flag-PARK7免疫印迹。右图：SN4741细胞的细胞质部分用抗HSPA8抗体进行免疫沉淀（IgG通道表明免疫沉淀中使用了对照IgG）。用抗PARK7抗体对沉淀进行PARK8免疫印迹。（B） LAMP2A对PARK7的影响。用pcDNA转染SN4741细胞三或在NH缺失或存在的情况下，将LAMP2A过表达构建48小时4通过免疫印迹法测定Cl和亮氨酸肽以及LAMP2A和PARK7的水平。右图显示了PARK7的量化（平均值±SEM，n=3；**，P（P）与对照组相比<0.01；#，P（P）与指示组相比<0.01）。（C） 上调LAMP2A对PARK7和LAMP1共定位的影响。SN4741细胞按（B）处理。通过免疫荧光测定PARK7和LAMP1的共定位。还提供了放大图像。计算共定位率。比例尺：50μm。（D） 降低LAMP2A对PARK7的影响。将表达对照或shRNA的慢病毒转染SN4741细胞Lamp2a灯通过免疫印迹法测定LAMP2A和PARK7的水平。右图显示了PARK7的量化（平均值±SEM，n=3；**，P（P）与对照组相比<0.01）。（E） PARK7的溶酶体结合和摄取。左面板：纯化溶酶体（含或不含蛋白酶抑制剂混合物（P.I.））与过度表达PARK7的HEK293细胞的裂解液在37°C下孵育20分钟。培养结束时，在0°C下用蛋白酶K（prot K；50μg/ml）处理样品10分钟。清洗后，通过免疫印迹法检测PARK7的存在。左侧面板：左侧通道对应于在没有P.I的情况下与溶酶体相关联的PARK7；中间通道显示蛋白酶K能有效去除与溶酶体膜结合的PARK7；右侧车道显示了在这种情况下与溶酶体相关联的PARK7总量。右侧面板：将纯化溶酶体与纯化PARK7在37°C下孵育20分钟，然后进行或不进行蛋白酶K和/或Triton X-100（Tx-100）处理（0°C下10分钟）。通过免疫印迹法测定PARK7、溶酶体HSP90和HSPA8的水平。（F） 已知CMA底物RNase a对PARK7与溶酶体结合的影响。实验如（E）右图所示，在37°C下增加或不增加RNase A浓度20分钟。通过免疫印迹法检测PARK7和RNase A的存在。下图显示了与溶酶体相关的PARK7的定量（平均值±SEM，n=3；*，P（P）< 0.05; **,P（P）与对照组相比<0.01）。（G） HSPA8与野生型（WT）或突变的PARK7之间的结合。野生型（WT）和突变型（QE）转染HEK293细胞的裂解物→AA或NR→AA）用抗HSPA8抗体免疫沉淀PARK7。用抗Flag抗体对沉淀进行Flag-PARK7免疫印迹。下图显示了用HSPA8免疫沉淀的Flag-PARK7的定量。（H） PARK7突变体QE的降解→AA和NR→血清剥夺导致AA。按照图1B所述处理转染有所示质粒的SN4741细胞。（一） PARK7突变体QE/AA与溶酶体的相互作用。表达PARK7 WT或QE的裂解物→AA与纯化溶酶体孵育，如（E）所述。右图显示了野生型和变异QE的量化→与溶酶体相关的AA标志-PARK7（平均值±SEM，n=3；**，P（P）< 0.01).
图3。
图3。
CMA降解氧化和损坏的PARK7。（A） MPP下CMA介导的PARK7降解+SN4741细胞转染表达sh的慢病毒Lamp2a灯用MPP治疗+（50μM），无论是否存在NH4通过免疫印迹法测定24小时的Cl和亮氨酸肽（Leup）以及PARK7的水平。下图显示了PARK7水平的量化（平均值±SEM，n=3；**，P（P）与对照组相比<0.01）。（B） 3-MA对MPP的影响+-诱导PARK7水平下降。用50μμMPP处理SN4741细胞+和10 mM 3-MA（无论是否存在NH）4Cl和leupeptin。通过免疫印迹法测定PARK7的水平。下图显示了PARK7水平的量化（平均值±SEM，n=4；**，P（P）与对照组相比<0.01）。（C） 还原LAMP2A对MPP后羰基PARK7水平的影响+治疗。慢病毒转染SN4741细胞的裂解产物灯2a用50μμMPP处理+用抗PARK7抗体免疫沉淀24小时。通过免疫印迹法测定PARK7和DNP衍生的羰基的水平。下图显示衍生羰基水平的量化（平均值±SEM，n=4；**和##,P（P）与对照组相比<0.01）。（D） PARK7 QE羰基氧化速率增加→AA突变体。用所示质粒转染SN4741细胞，并用50μμMPP处理+持续12小时，并按照（C）中所述进行分析。右图显示衍生羰基水平的量化（平均值±SEM，n=3**P（P）< 0.01). #x2206；质量工程、质量工程→AA.（E）击倒LAMP2A后PARK7酸性形式的积累。SN4741细胞按（A）所述进行处理。蛋白质提取物通过2D凝胶电泳分离并分析PARK7。右图显示了PARK7酸性形式的定量（平均值±SEM；n=3；*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01). （F） 溶酶体和CMA活性对PARK7单体和二聚体的影响。NH处理SN4741细胞4Cl和亮氨酸肽（Leuppeptin，Leup）或在指定时间内剥夺血清，或转染慢病毒Lamp2a灯然后用DSS（5 mM）处理。免疫印迹法检测PARK7水平。（G） CMA降解PARK7单体。按照（A）和（F）所述处理的SN4741细胞的裂解液通过免疫印迹分析PARK7单体和二聚体。右图显示了PARK7单体和二聚体形式的定量（平均值±SEM，n=4；**，P（P）与对照组相比<0.01，P（P）与指示组相比<0.05）。
图4。
图4。
CMA通过PARK7调节线粒体。（Ato C）PARK7过度表达对sh的影响灯2A-和MPP+-诱导线粒体功能障碍。转染对照GFP或sh的SN4741细胞Lamp2a绿色荧光蛋白用对照质粒或PARK7质粒转染慢病毒，并用MPP处理+（50μM）持续24小时并进行分析（平均值±SEM；n=3；*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01). 对于线粒体形态，细胞用MitoTracker红（10nM）在33°C下染色20分钟。使用ImageJ 1.41软件（A）通过活细胞成像（尼康，C2 Si，日本）（绿色，GFP；红色，MitoTracker red；插图代表方框区域）分析活SN4741细胞的线粒体形态。右图显示了线粒体的形状因子，它反映了复杂性和分支，计算为（周长2)/（4π·表面积）。对于MMP，细胞与TMRE（200 nM）在33°C下孵育20分钟。用流式细胞术（B）检测一万个细胞的TMRE荧光。对于ROS水平，细胞与CellROX孵育→ 深红色试剂（2.5μμ）。检测了一万个细胞的CellROX→ 流式细胞术检测深红色试剂荧光（C）。比例尺：50μm。（D至F）下调PARK7对LAMP2A诱导的线粒体保护作用公园7用MPP治疗+（50μM）持续24小时。线粒体功能测定如（Ato C）所述（平均值±SEM；n=3；*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01). 比例尺：50μm。（G和H）过度表达PARK7 QE的影响→氧化应激下MMP（G）和ROS（H）上的AA。用所示质粒转染SN4741细胞并用MPP处理+持续24小时。如上所述测定MMP和ROS。右图显示了量化（平均值±SEM；n=3；*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01).
图5。
图5。
CMA-PARK7通路对SN4741细胞活性的调节。（A和B）调节LAMP2A或PARK7对MPP的影响+-TUNEL诱导细胞凋亡。按照图4A或4D处理的SN4741细胞进行TUNEL染色（平均值±SEM；n=3）。TUNEL面板中的数字表示TUNEL阳性细胞/总细胞的比率。比例尺：100μm。（C和D）调制LAMP2A或PARK7对MPP的影响+-通过LDH释放试验诱导细胞死亡。通过LDH释放试验（平均值±SEM；n=3；*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01).
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