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.2016年8月；138(3):407-22.
doi:10.1111/jnc.13664。 Epub 2016年6月22日。

FABP-1基因消融对雄性小鼠脑内大麻素系统的影响

格雷戈里·G·马丁 1, 莎拉·钟 1 2, Danilo Landrock公司 2, Kerstin K Landrock公司 2, 黄欢 1, 劳伦斯·丹戈特 三, 彭晓雪 4, 马丁·卡奇查 4, 德鲁·R·西格 5, 埃里克·J·墨菲 5, 米哈伊尔·戈洛夫科 5, 安·B·基尔 2, 弗里德海姆·施罗德 1
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FABP-1基因消融对雄性小鼠脑内源性大麻素系统的影响

格雷戈里·G·马丁等。 神经化学杂志. 2016年8月.

摘要

肝脏脂肪酸结合蛋白（FABP1，L-FABP）对花生四烯酸（ARA，C20:4，n-6）具有高亲和力并增强其摄取，当花生四烯酸酯化为磷脂时，花生四烯酸是合成内源性大麻素（EC）的必要前体，如花生四烯酸乙酰胺（AEA）和2-花生四烯酸甘油（2-AG）。大脑的大部分ARA来自血浆，吸收ARA并通过位于大脑内的胞浆脂肪酸结合蛋白（FABPs 3、5和7）在细胞内转运。相反，更普遍的细胞溶质FABP1在大脑中无法检测到，而是在肝脏中高度表达。因此，在野生型（WT）和FABP1阴性（LKO）雄性小鼠中，研究了中枢神经系统外的FABP1可能调节大脑AEA和2-AG的可能性。LKO增加了大脑中含AA EC（AEA，2-AG）的水平，与大脑和血清中游离ARA和总ARA的增加相关。LKO还增加了大脑中非ARA的水平，这些非ARA含有增强的内源性大麻素（EC*），如油酰乙醇酰胺（OEA）、PEA、2-OG和2-PG。同时，LKO降低了血清总含ARA的EC，但不降低非ARA内源性大麻素。LKO没有引起脑EC和EC*的这些变化，这是由于EC合成酶（NAPEPLD，DAGLα）或胞浆EC伴侣蛋白（FABPs 3，5，7，SCP-2，HSP70）或大麻素受体（CB1，TRVP1）的脑蛋白水平的代偿性上调。这些数据首次表明，非CNS脂肪酸结合蛋白FABP1显著影响了大脑中含有ARA的内源性大麻素（AEA，2-AG）及其非ARA增强的内源性大麻素的水平。脂肪酸结合蛋白-1（FABP-1）在大脑中无法检测到，但在肝脏中高度表达。在野生型（WT）和FABP-1阴性（LKO）雄性小鼠中，研究了中枢神经系统外的FABP1可能调节大脑内源性大麻素类花生酰乙醇酰胺（AEA）和2-花生酰甘油（2-AG）的可能性。LKO增加了大脑中含有花生四烯酸的内源性大麻素类物质（AEA，2-AG）的水平，与大脑和血清中游离和总花生四烯酸量的增加相关。阅读第371页这篇文章的编辑亮点。

关键词：脑；内源性大麻素；基因消融；肝脂肪酸结合蛋白；鼠标。

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利益冲突声明

利益冲突：作者声明，他们与本文的内容没有利益冲突。

数字

图1
图1
FABP1基因消融显著增加大脑N-酰基乙醇酰胺水平。将C57BL/6N雄性WT和FABP1基因切除小鼠（8周龄）喂食无植物性、无植物雌激素的对照食物4周，隔夜禁食，取脑/速冻并储存在−80°C。使用氘化内标物（Cayman Chemical）进行LC-MS分析，以量化N-酰基乙醇胺，如材料和方法中所述，以量化（A）花生酰乙醇酰胺（AEA）、（B）油酰乙醇酰胺。结果显示为平均值±SEM（n=8）；*，LKO的p<0.05与重量。
图2
图2
FABP1基因消融增加大脑2-单酰甘油水平。C57BL/6N雄性WT和FABP1基因切除小鼠（8周龄）被喂食无植物性、无植物雌激素的对照食物4周，隔夜禁食，取脑/速冻并储存在−80°C。使用氘化内标物（Cayman Chemical）进行LC-MS分析以量化2-单酰基甘油，如材料和方法中所述，以量化（A）2-花生酰甘油（2-AG）、（B）2-油酰基甘油（2-OG）和（C）2-棕榈酰甘油（2-PG）。结果显示为平均值±SEM（n=8）；*，LKO的p<0.05与重量。
图3
图3
FABP1基因消融会影响血清和大脑中非酯化花生四烯酸和总花生四烯醇酸的水平。WT和FABP1基因切除小鼠（8周龄）喂食不含植物醇、不含植物雌激素的对照食物4周，禁食过夜，收集血清和大脑/快速冷冻，并在−80°C下储存。按照材料和方法中的描述，进行脂质提取和LC-MS分析，以使用氘化内标物（Cayman Chemical）定量花生四烯酸，以定量（A）总花生四烯酸盐（总ARA）和（B）游离花生四烯醇酸（游离ARA）。结果显示为平均值±SEM（n=5–7）；*，LKO的p<0.05与重量
图4
图4
FABP1基因消融降低血清N-酰基乙醇酰胺和2-单酰基甘油水平。所有条件均如图1和图2的图例所示，但血清中NAE和2-MGs的测定如材料和方法中所述，以量化（A）花生酰乙醇酰胺（AEA）、（B）油酰乙醇酰胺，（C）棕榈酰乙醇酰胺、（D）二十二碳六烯醇乙醇酰胺（DHEA）、（E）2-花生酰甘油（2-AG）、（F）2-油酰基甘油（2-OG）和（G）2-棕榈酰甘油（2-PG）。结果显示为平均值±SEM（n=8）；*，LKO的p<0.05与重量。
图5
图5
FABP1基因消融对参与ARA摄取的脑膜蛋白水平的影响。将C57BL/6N雄性WT和FABP1基因切除小鼠（8周龄）喂食无植物性、无植物雌激素的对照食物4周，隔夜禁食，取脑/速冻并储存在−80°C。如前所述（Martin等。2015年），以确定（A）CD36/FAT、（B）CAV1、（C）FATP1和（D）FATP4的水平。插图显示了相应蛋白质（上部印迹）和凝胶负载控制蛋白质（β-肌动蛋白或GAPDH，下部印迹）的代表性蛋白质印迹图像。相对蛋白质水平归一化为凝胶负荷控制蛋白；值与设置为1的WT进行比较。结果为平均值±SEM（n=7）；*，LKO的p<0.05与重量。
图6
图6
FABP1基因消融改变脑细胞溶质“伴侣”脂肪酸和内源性大麻素结合蛋白的蛋白水平。所有条件如图5所示，不同之处在于按照所述进行蛋白质印迹分析（Martin等。2015;卡奇查等。2009年），以确定（A）FABP3、（B）FABP5、（C）FABP7、（D）SCP-2和（E）HSP70的蛋白质水平。插图显示了相应蛋白质（上部印迹）和凝胶负载控制蛋白质（GAPDH或β-肌动蛋白，下部印迹）的代表性蛋白质印迹图像。相对蛋白质水平归一化为凝胶负荷控制蛋白；将值与设置为1的WT进行比较。结果显示为平均值±SEM（n=7）；*，LKO的p<0.05与重量。
图7
图7
SCP-2结合AEA和2-AG：荧光顺式磷酸置换试验。SCP-2（500 nM）与顺式丙酸（500 nM）进行平衡，然后用不断增加的AEA（0-5μM）或2-AG（0-3μM）进行滴定。随着AEA（封闭黑圈）和2-AG（开放圈）浓度的增加，顺-丙酸排放量减少（Ex=304 nm，Em max=420 nm）。K（K）我s是根据已知K计算得出的d日材料和方法中所述的AEA和2-AG取代顺-丙酸的EC50。结果显示为平均值±SEM（n=6）。
图8
图8
FABP1基因消融对参与内源性大麻素合成和降解的脑蛋白水平的影响。所有条件均如图5所示，但Western blot分析按所述进行（Martin等。2015;卡奇查等。2009年），以确定（A）NAPEPLD、（B）DAGLα、（C）FAAH、（D）NAAA和（E）MAGL的蛋白质水平。插图显示了相应蛋白质（上部印迹）和凝胶负载控制蛋白质（GAPDH或β-肌动蛋白，下部印迹）的代表性蛋白质印迹图像。相对蛋白质水平归一化为凝胶负荷控制蛋白；值与设置为1的WT进行比较。结果显示为平均值±SEM（n=7）。
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